STAT1在高糖作用體外培養(yǎng)人腎小球系膜細胞自噬和衰老中的作用機制研究.pdf

1、目的：
　　在我國，老齡化問題已日趨嚴重，甚至已成為全球性重大問題之一。腎臟是受衰老影響最明顯的器官之一。隨著年齡的增加，慢性腎臟病(CKD)的發(fā)病率逐年上升，說明衰老是進展性腎臟病的重要因素。因此，尋找有效延緩腎臟衰老的方法尤為重要，也是國內(nèi)外學者關(guān)注的重要問題之一。
　　人腎小球系膜細胞(HGMC)是腎臟主要的固有細胞，也是腎小球中功能最活躍的細胞。器官衰老與細胞衰老之間有著密不可分的聯(lián)系。目前HGMC已經(jīng)被應(yīng)用為研究腎

2、臟衰老機制切入點。而衰老的機制非常復(fù)雜，至今并未完全闡明。自噬是最近鑒別出的新的衰老相關(guān)機制之一。多項研究表明增強自噬可以延緩衰老。因此積極尋找調(diào)控自噬的通路對腎臟衰老機制的研究至關(guān)重要。
　　STAT1是信號傳導和轉(zhuǎn)錄活化子蛋白(STAT)家族中第一個被發(fā)現(xiàn)的蛋白。有研究表明STAT1在調(diào)控心肌細胞凋亡的同時也負向調(diào)控自噬。我們前期研究發(fā)現(xiàn)STAT1參與了高糖體外培養(yǎng)HGMC的衰老過程，但其在HGMC衰老中的作用機制尚不十分清楚

3、。本研究通過高糖（含糖30mmol/L）刺激HGMC誘導衰老模型，觀察HGMC衰老過程中自噬與STAT1是否有一定關(guān)聯(lián)及自噬與衰老的關(guān)系，并通過藥物特異性抑制及基因沉默STAT1對HGMC自噬和衰老的影響，以進一步探討研究腎臟衰老機制從而延緩腎臟衰老提供新的理論依據(jù)。
　　材料和方法：
　　1、HGMC衰老的誘導、HGMC衰老過程中STAT1、PSTAT1及自噬活性的變化和自噬對P53/P21信號通路的影響
　　采用高

4、糖作為誘導HGMC衰老的刺激因素，建立HGMC衰老模型，細胞同步化后分為：正常糖對照組（含糖5.5mmol/L）;高滲對照組（含糖5.5mmol/L+甘露醇24.5mmol/L）;高糖組（含糖30.0mmol/L）作用不同時間點組：12h、24h、48h、72h;高糖加自噬增強劑雷帕霉素（RAPA）干預(yù)組（含糖30.0mmol/L+RAPA500nmol/L，培養(yǎng)72h，其中RAPA提前一小時刺激）;高糖加自噬抑制劑3MA干預(yù)組（含糖3

5、0.0mmol/L+3MA2mmol/L，培養(yǎng)72小時，其中3MA提前一小時刺激）。通過細胞形態(tài)、β-半乳糖苷酶染色陽性率、Western blot法檢測衰老相關(guān)蛋白P53、P21表達變化證實HGMC衰老并檢測STAT1、PSTAT1、自噬相關(guān)指標LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62的變化以及電鏡觀察自噬小體數(shù)量，另外通過應(yīng)用RAPA和3MA干擾自噬活性后，檢測高糖誘導HGMC衰老過程中P53及P21的表達變化。
　　2、干擾STAT1后，

6、HGMC自噬活性和衰老的變化
　　分別以STAT1—siRNA轉(zhuǎn)染HGMC對STAT1基因沉默以及應(yīng)用不同濃度氟達拉濱對STAT1特異性藥物抑制，用上述濃度的高糖刺激相應(yīng)時間，同樣設(shè)立高滲對照組同上，應(yīng)用光鏡觀察細胞形態(tài)、Western blot檢測STAT1、PSTAT1和自噬標記蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62表達變化、透射電鏡觀察自噬體的形成，另外觀察β-半乳糖苷酶染色陽性率。
　　結(jié)果：
　　1、HGMC衰老表型

7、特征以及HGMC衰老過程中STAT1、PSTAT1、自噬活性的變化和自噬對P53/P21信號通路的影響
　　光鏡下觀察：正常糖組細胞呈條梭形生長、排列規(guī)則、細胞邊界清晰，多呈單核表現(xiàn);高滲對照組細胞隨著培養(yǎng)時間延長，體積逐漸增大，細胞出現(xiàn)水腫，其中偶見顆?；蚩张荩帕胁灰?guī)則;與正常糖組比較，高糖組細胞隨著培養(yǎng)時間延長，多形核及雙核細胞逐漸增多，細胞體積變大，胞漿區(qū)域扁平，其中常見顆?；蚩张荩帕胁灰?guī)則。β-半乳糖苷酶染色陽性率：與

8、正常糖組11.37±2.92％比較，高糖組細胞88.35±2.33％明顯升高，差異有顯著性(P＜0.05)，而高滲對照組14.35±4.80％無顯著增加。電鏡下自噬體數(shù)量觀察：與正常糖組每個細胞內(nèi)自噬體數(shù)量11.50±2.26比較，高糖刺激48小時組5.67±2.33和高糖刺激72小時組6.00±2.28顯著降低(P＜0.05)，而高滲對照組11.50±2.17無顯著差異。Western blot結(jié)果：與正常糖組比較，高糖作用48和72

9、小時組STAT1、PSTAT1、P62、P53、P21表達均顯著增加(P＜0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達顯著下降(P＜0.05)，而高滲對照組無顯著性差異。應(yīng)用自噬增強劑和抑制劑刺激干預(yù)72小時后，β-半乳糖苷酶染色陽性率：與正常糖組19.74±2.54％比較，高糖組88.78±1.82％顯著升高，(P＜0.05)，高滲對照組20.21％±1.20無顯著性差異;與高糖組比較，高糖加RAPA組43.04±4.71％顯著下降(P＜0.0

10、5)，高糖加3MA組83.49±3.13％無顯著差異。Western blot結(jié)果：與正常糖組比較，高糖組P62、P53、P21表達顯著增加(P＜0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達顯著下降(P＜0.05)，高滲對照組無顯著差異;與高糖組比較，高糖加RAPA組P62、P53、P21表達顯著下降(P＜0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達顯著升高(P＜0.05)，高糖加3MA組無顯著性差異。
　　2、干擾STAT1后，HGMC自噬活性和衰

11、老表型特征的變化
　　光鏡下觀察：正常糖組細胞呈條梭形生長、排列規(guī)則、細胞邊界清晰，多呈單核表現(xiàn);高滲對照組細胞隨著培養(yǎng)時間延長，體積逐漸增大，細胞出現(xiàn)水腫，其中偶見顆?；蚩张?，排列不規(guī)則;與正常糖組比較，高糖組細胞多形核及雙核細胞逐漸增多，細胞體積變大，胞漿區(qū)域扁平，其中常見顆?；蚩张?，排列不規(guī)則;與高糖組比較，高糖加氟達拉濱干預(yù)組細胞隨著氟達拉濱濃度增高，細胞形態(tài)逐漸趨于條梭形生長、排列規(guī)則、細胞邊界清晰，但氟達拉濱最高濃度1

12、00umol/L組細胞數(shù)量明顯見少，視野下觀察細胞數(shù)量小于50％。Western blot結(jié)果：與正常糖組比較，高糖組STAT1、PSTAT1、P62表達明顯增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達明顯下降，高滲對照組無明顯差異;與高糖組比較，高糖加氟達拉濱(50umol/L)干預(yù)組及高糖加STAT1-siRNA組STAT1、PSTAT1、P62表達明顯降低，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達明顯增加。電鏡下自噬體數(shù)量觀察：與正常糖組每個細胞內(nèi)自噬體數(shù)量11.

13、50±2.26比較，高糖組6.00±2.28顯著降低(P＜0.05），而高滲對照組11.50±2.17無顯著性差異;與高糖組比較，高糖加氟達拉濱(50umol/L)組19.16±7.08和高糖加STAT1-siRNA組23.66±7.66顯著性升高(P＜0.05)。β-半乳糖苷酶染色陽性率：與正常糖組21.18±2.31％比較，高糖組85.53±1.85％顯著性升高(P＜0.05)，高滲對照組21.84±2.30無顯著性差異;與高糖組比

14、較，高糖加氟達拉濱(50umol/L)組49.67±5.36％和高糖加STAT1-siRNA組48.50±3.63％顯著性下降（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、高糖30mmol/L于體外刺激HGMC72小時可以誘導其衰老，且其促衰老作用與高滲透壓無關(guān);高糖可激活HGMC STAT1通路，隨著延長高糖作用HGMC刺激時間，自噬活性受到抑制，并出現(xiàn)衰老表達;高糖可激活P53/P21通路，通過增強自噬活性，可以抑制P53/P