高糖對人系膜細胞CTGF及其受體LRP表達的影響.pdf

1、研究背景：
　　 眾所周知，高血糖是導致糖尿病腎臟病(Diabetic kidneydisease，DKD)的始動因素，因此探討高糖對腎臟的影響及其作用機制成為早期防治DKD研究的必然環(huán)節(jié)。關于高血糖對腎臟的影響及相關機制的動物實驗研究已不勝枚舉，但高糖對人體腎臟組織細胞的具體危害及其具體作用機制尚待進一步明確，因此這方面的研究成了本領域的研究熱點。尤其是高糖通過各種細胞因子、各種信號途徑對腎臟固有細胞如系膜細胞、足細胞、內(nèi)皮細

2、胞及腎小管上皮細胞的影響等方面的研究越來越多，越來越深入。高糖對腎臟結締組織生長因子(Connective tissue growth factor，CTGF)的表達的影響和相應機制研究正是目前研究的熱點之一。
　　 系膜細胞具有重要的生理功能：是腎小球毛細血管叢的主要支架，具有收縮、分泌功能，可以通過其系膜細胞膜上的血管活性物質受體，根據(jù)機體需要調(diào)節(jié)收縮從而改變腎臟濾過膜的濾過面積；系膜細胞還具有很強的吞噬能力，對清除腎小球濾

3、過的某些大分子物質起著重要作用。眾所周知，高血糖是DKD發(fā)生始動因素和核心因素，而系膜細胞的上述生理學特性決定了它是糖尿病眾多致病因子作用的主要靶細胞之一。然而，人類腎小球系膜細胞的原代培養(yǎng)一直存在不少困難，諸如：培養(yǎng)細胞的成功率低、生存時間較短，傳代困難或傳代次數(shù)太少等問題，從而阻礙了針對人腎小球系膜細胞的實驗研究的開展，極大地影響了腎小球相關疾病研究的進展。
　　 CTGF作為一種富含半胱氨酸的分泌型蛋白，具有很強的促纖維化

4、效應。目前已知，CTGF的主要作用機理是通過自分泌、旁分泌等方式來誘導多種細胞的分化、增殖，并且參與介導這些細胞的遷移、黏附、聚集，促進組織細胞外基質的合成和沉積，從而導致相應靶器官的纖維化。另外，已證實CTGF還具有誘導血管生成、參與組織細胞的創(chuàng)傷修復以及誘導細胞凋亡等一系列生物學功能。CTGF在人體多種組織器官中廣泛存在，它作為一種重要的細胞因子參與了細胞外基質合成和沉積，而后者正是組織纖維化的一個重要機制。研究發(fā)現(xiàn)腎臟是人體眾多組

5、織器官中含有CTGF最多的器官之一，腎臟的多種固有細胞均可表達CTGF，并在某些因素如氧化應激、缺氧、高糖等作用下出現(xiàn)高表達。已有實驗證實，CTGF可通過介導糖基化終末產(chǎn)物這一經(jīng)典途徑促進腎臟系膜細胞合成膠原蛋白和纖維黏連蛋白，從而參與了腎臟纖維化的進展。新近研究不僅在DKD動物模型的腎臟組織中發(fā)現(xiàn)了CTGF的高表達，而且在DKD患者腎臟組織中也有類似的發(fā)現(xiàn)，因此認為CTGF作為一種非常重要的促纖維化因子在DKD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要

6、作用。
　　 本課題組近年的研究顯示，在糖尿病大鼠腎臟病變早期就已經(jīng)開始出現(xiàn)腎組織中CTGF的高表達以及血、尿CTGF濃度的增加，而且血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑厄貝沙坦可通過降低血CTGF水平來減輕糖尿病大鼠腎臟損傷。另外也有學者檢測到1型糖尿病患者血漿中CTGF水平升高，并且這種變化甚至在微量白蛋白尿出現(xiàn)之前就已經(jīng)發(fā)生，而且其水平的變化與患者的蛋白尿水平和腎功能(內(nèi)生肌酐清除率)有著很高的相關性。以上研究均提示CTGF與DKD的發(fā)

7、生、發(fā)展密切相關。因此，該因子今后極有可能成為早期診治DKD以及判斷預后的重要指標。但是上述血和尿中CTGF水平升高的具體來源以及其表達增加的病理生理意義到目前還不十分清楚。據(jù)已有的文獻報道，CTGF可通過某種機制誘導體外培養(yǎng)的腎臟系膜細胞和足細胞發(fā)生增生、肥大，而系膜細胞肥大是DKD早期腎組織的主要病理特征之一。
　　 目的：
　　 1.培養(yǎng)重復性好、可多次傳代的人腎小球系膜細胞(HMC)
　　 2.探討高糖環(huán)

8、境對體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞(HMC)表達結締組織生長因子(CTGF)及其受體-低密度脂蛋白受體相關蛋白(lowdensity lipoprotein receptor-related protein，LRP)的影響以及相應的信號機制。
　　 研究方法：
　　 1.體外HMC培養(yǎng)：取成人腎臟腫瘤術后相對遠離腫瘤的腎組織、水囊引產(chǎn)的胎兒腎臟組織，通過3層篩網(wǎng)濾過分離，選取最下層篩網(wǎng)上腎組織，采用膠原酶消化后，培養(yǎng)正常人腎

9、小球系膜細胞，用系統(tǒng)性觀察和免疫熒光檢查等方法進行鑒定后傳代培養(yǎng)。
　　 2.高糖刺激實驗：以體外培養(yǎng)的HMC為研究對象，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ABC-ELISA)測定正常糖組(NG組)、高糖組(HG組)和甘露醇組(MG組)培養(yǎng)液中CTG F、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(phospho-extracellular signal-regulated kinase，pERK)及LPR的濃度變化，分別觀察高糖環(huán)境對系膜細胞CTG

10、F蛋白表達、絲裂素激活蛋白激酶(MAPKS)信號通路的活化以及CTGF受體LRP表達的影響。
　　 結果：
　　 1.經(jīng)形態(tài)學、免疫熒光檢查等方法鑒定證實培養(yǎng)細胞是腎小球系膜細胞，成人腎臟原代培養(yǎng)2周后才可傳代，胎兒腎系膜細胞原代培養(yǎng)1周即可傳代，且可連續(xù)培養(yǎng)至第7代以上。
　　 2.H MC本身存在基礎水平的CTGF蛋白表達，在高糖環(huán)境中培養(yǎng)1 d后，CTGF蛋白表達升高，峰值出現(xiàn)在第3d，自第4d開始下降；而

11、對照組CTGF蛋白表達未隨時間發(fā)生顯著變化；高糖環(huán)境下HMC外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)出現(xiàn)動態(tài)活化：1 h即開始檢測到pERK升高，峰值出現(xiàn)在第8至24h，于48h內(nèi)降至基礎水平，而對照組在各時點均未能檢測到pERK表達；加入PD98059(ERK活化特異抑制劑)后發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境對HMC表達CTGF蛋白增加的影響被抵消；另外，高糖環(huán)境未影響LRP的表達。
　　 結論：
　　 1.利用3層濾網(wǎng)分離人腎小球系膜細胞法簡便高效，所