siRNA沉默CTGF表達對高糖誘導小鼠足細胞損傷的影響.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)臨床上以持續(xù)性蛋白尿和腎功能進行性減退并最終進展至終末期腎衰竭為主要特征,目前是糖尿病嚴重并發(fā)癥之一。在DN發(fā)病早期,以尿微量白蛋白為主要表現(xiàn),而尿蛋白是加重慢性腎臟病發(fā)展的因素之一,因此研究蛋白尿的發(fā)生機制,抑制尿蛋白生成是DN研究熱點之一。近年發(fā)現(xiàn),足細胞在DN的發(fā)展過程中起重要作用,足細胞損傷后濾過膜電荷屏障和孔徑屏障的破壞,是蛋白尿形成的重要原

2、因。足突間的裂孔膜蛋白的完整性是腎小球濾過機械屏障的關(guān)鍵,細胞膜表面及裂孔膜表面帶負電荷的唾液酸糖蛋白,是腎小球濾過電荷屏障的重要組成部分,這些蛋白的損傷或表達下降都可引起足細胞結(jié)構(gòu)和功能障礙。裂孔膜蛋白主要包括了nephrin、podocin等蛋白。通過二聚體形成拉鏈樣結(jié)構(gòu),nephrin構(gòu)成了裂孔隔膜的分子基礎。而podocin可與nephrin相互作用形成復合體錨定于足細胞肌動蛋白骨架上,構(gòu)成了腎小球正常結(jié)構(gòu)及維持了濾過功能。近年

3、來,結(jié)締組織生長因子(connectivetissue growth factor,CTGF)在DN中的致病作用逐漸引起廣泛關(guān)注,但主要著重于探索CTGF與腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition,EMT)導致腎小管肥大、間質(zhì)纖維化的關(guān)系。而CTGF是否參與了DN早期足細胞損傷,及其調(diào)節(jié)機制卻鮮見報道。
　　 本實驗通過Realtime PCR,Western蛋白印跡分析、siRN

4、A干擾等技術(shù),探討CTGF對高糖誘導的足細胞相關(guān)蛋白表達的影響。
　　 一、研究目的：
　　 觀察高糖培養(yǎng)對小鼠足細胞CTGF、nephrin、podocin mRNA和蛋白表達的影響及轉(zhuǎn)染pshRNA-CTGF-1質(zhì)粒抑制CTGF表達前、后小鼠足細胞CTGF、nephrin、podocin mRNA及蛋白水平的變化。
　　 二、研究方法：
　　 1.利用計算機輔助設計軟件設計3條針對CTGF的siRNA

5、s(siRNA—CTGF-1、siRNA-CTGF-2及siRNA-CTGF-3)和1條無關(guān)序列(siRNA—CTGF-neg)作為陰性對照,并合成包含這4條siRNAs的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)的模板脫氧寡核苷酸序列。
　　 2.根據(jù)合成的shRNA模板脫氧寡核苷酸序列,分別將其插入pGenesil—1質(zhì)粒,完成特異性siRNA的質(zhì)粒的構(gòu)建,共構(gòu)4種質(zhì)粒:pshRNA-CTGF-1、pshRNA-CTGF-2、pshRNA

6、-CTGF-3、表達無關(guān)序列的質(zhì)粒pshRNA—CTGF-neg。
　　 3.把上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α E.coli菌液,挑取生長較好的單克隆菌落,搖菌,提取小量質(zhì)粒進行酶切及基因測序鑒定。根據(jù)鑒定,選取正確的細菌克隆進行大量的質(zhì)粒提取。
　　 4.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到高糖組培養(yǎng)48小時后的細胞,用空質(zhì)粒載體做空白對照。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)于高糖培養(yǎng)基中,于48h收集細胞,以RT-PCR檢測CTGFmRNA的表達水平。挑選出si

7、RNA—CTGF-1、siRNA-CTGF-2及siRNA-CTGF-3中抑制效果最好的siRNA表達載體進行下一步實驗。
　　 5.全部細胞分成6組培養(yǎng):正常對照組(D—glu1g/L)、高糖組(D-glu4.5g/L)、等滲對照組(D-glu1 g/L+甘露醇3.5g/L)、高糖+空白對照組(D-glu4.5g/L+空載)、高糖+陰性對照組(D-glu4.5g/L+pshRNA—CTGF-neg)、高糖+siRNA—CTGF

8、組(D-glu4.5g/L+siRNA-CTGF)。
　　 6.各組分別培養(yǎng),于24、48h時收集細胞以Real-time熒光定量PCR檢測各組CTGF、nephrin、podocin mRNA表達水平。
　　 7.各組分別培養(yǎng),于24、48h時收集細胞以Western blot方法檢測CTGF、nephrin、podocin的蛋白表達水平。
　　 三、結(jié)果：
　　 1.高糖刺激可上調(diào)小鼠足細胞CTGF

9、mRNA及蛋白水平,同時伴有nephrin、podocin mRNA及蛋白表達水平的下降。
　　 2.轉(zhuǎn)染siRNA-CTGF-1能顯著抑制高糖誘導的小鼠足細胞的CTGFmRNA及蛋白的表達增多,及nephrin、podocin mRNA及蛋白表達減少。這些變化與轉(zhuǎn)染方式及過程無關(guān)。提示CTGF是介導高糖誘導足細胞凋亡的重要因素。
　　 四、結(jié)論：
　　 本研究成功觀察到高糖條件下培養(yǎng)的足細胞CTGF的mRNA及