siRNA干擾NOX4基因?qū)Ω咛谴碳ば∈竽I小球足細(xì)胞產(chǎn)生微囊泡的影響.pdf

1、目的：
　　本研究進(jìn)一步探討 NADPH氧化酶NOX4介導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)高糖刺激足細(xì)胞損傷及產(chǎn)生微囊泡過程中的作用。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)MPC-5細(xì)胞，高糖組處理因素為30mM葡萄糖。
　　1.采用RT-qPCR、Western Blot技術(shù)分別檢測(cè)高糖刺激MPC-5細(xì)胞2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)后NOX4 mRNA、蛋白的水平，確定高峰時(shí)間點(diǎn)。
　　2.對(duì)MPC-5細(xì)胞進(jìn)行FAM-si

2、RNA轉(zhuǎn)染，濃度范圍為0-150nM，熒光顯微鏡觀察熒光，確定最佳轉(zhuǎn)染濃度。
　　3.以最佳濃度對(duì)MPC-5細(xì)胞進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，采用RT-qPCR技術(shù)篩選轉(zhuǎn)染率最高的siRNA序列。
　　4.將MPC-5細(xì)胞分為6組，分別為正常組、NOX4 siRNA組、陰性siRNA組、高糖組、高糖+NOX4 siRNA組、高糖+陰性siRNA組，高糖干預(yù)時(shí)間為方法1中NOX4蛋白水平高峰時(shí)間點(diǎn)，采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)各

3、組NOX4蛋白的水平，采用ELISA技術(shù)檢測(cè)各組MPC-5細(xì)胞產(chǎn)生MVs的含量。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Xs)表示。兩組以上比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1. NOX4 mRNA檢測(cè)結(jié)果：隨高糖刺激時(shí)間的延長，NOX4 mRNA表達(dá)水平呈先升高后降低的趨勢(shì)，與正常對(duì)照（NC）組相比，2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、

4、12小時(shí)、24小時(shí)分別是NC組的2.61、1.94、1.83、1.52、1.11倍，可見2小時(shí)達(dá)高峰，隨后逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P<0.01）。
　　2. NOX4蛋白檢測(cè)結(jié)果：隨高糖刺激時(shí)間延長，NOX4蛋白表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，與正常對(duì)照（NC）組相比，2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)分別是NC組的1.14、2.08、1.63、1.51、0.96倍，可見4小時(shí)達(dá)高峰，隨后逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)（P<0.01）

5、。
　　3. FAM-siRNA轉(zhuǎn)染MPC-5細(xì)胞結(jié)果：熒光顯微鏡下觀察足細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光，當(dāng)siRNA濃度在50-125nM之間時(shí)，隨siRNA濃度增加，含有綠色熒光的細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，當(dāng)siRNA濃度達(dá)150nM時(shí)，可見多數(shù)細(xì)胞被殺傷，說明siRNA濃度為125nM時(shí)轉(zhuǎn)染效率最佳。
　　4.不同序列siRNA轉(zhuǎn)染足細(xì)胞NOX4 mRNA檢測(cè)結(jié)果：與正常對(duì)照組、lipo2000組、陰性siRNA組、siRNA-A組、si

6、RNA-C組相比，siRNA-B組NOX4 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），說明siRNA-B序列干擾NOX4基因的效率最佳。
　　5. NOX4siRNA轉(zhuǎn)染后高糖刺激足細(xì)胞NOX4蛋白檢測(cè)結(jié)果：NOX4siRNA組（2組），與正常組（1組）相比，NOX4蛋白表達(dá)降低了54.1％（P＜0.01）；高糖組（3組），較1、2組NOX4蛋白表達(dá)升高，分別為1、2組的2.20、4.79倍（P＜0.01）；高糖+NOX4 siR

7、NA組（4組），與3組相比，NOX4蛋白表達(dá)降低了59.7%，為2組的1.93倍（P＜0.01）；陰性siRNA組、高糖+陰性siRNA組，分別與1、3組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　6. NOX4 siRNA轉(zhuǎn)染后高糖刺激足細(xì)胞產(chǎn)生MVs檢測(cè)結(jié)果：NOX4 siRNA組，較正常組（1組）MVs濃度降低17.6%（P＜0.05），高糖組（3組），較1、2組MVs濃度升高，分別為1、2組的2.1、2.55倍（P＜0.

8、01）；高糖+NOX4 siRNA組（4組），與3組相比，MVs濃度降低了48.0%（P＜0.01），較2組升高24.5%（P＜0.01），與1組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陰性siRNA組、高糖+陰性siRNA組，分別與1、3組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.高糖可以增加足細(xì)胞NOX4 mRNA及蛋白的表達(dá)，呈時(shí)間依賴性。
　　2.高糖可以刺激足細(xì)胞MVs產(chǎn)生增加，NOX4 siR