糖尿病腎病腎小球足細(xì)胞損傷機(jī)制的研究——高糖通過NFAT2-BAX信號途徑誘導(dǎo)腎小球足細(xì)胞凋亡.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是1型和2型糖尿病的一個(gè)重要和常見的并發(fā)癥，雖然目前有多項(xiàng)醫(yī)療措施可延緩疾病進(jìn)展，但是仍約三分之一的糖尿病患者發(fā)展為終末期腎臟疾病，需要行腎臟替代治療。因此，探索糖尿病腎病中促進(jìn)腎小球損傷的機(jī)制，以期獲得新的治療策略，是目前醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　 腎小球的濾過屏障由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell)、腎小球基底膜(Glom

2、erular basement memberane，GBM)以及足細(xì)胞(Podocyte)組成。腎小球足細(xì)胞是一種終末分化的細(xì)胞，它駐留在腎小球基底膜的外表面上，并在維持腎小球?yàn)V過屏障的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。越來越多的證據(jù)表明，腎小球足細(xì)胞在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了舉足輕重的作用。一些研究表明，在1型和2型糖尿病中，足細(xì)胞的損傷和減少是DN發(fā)病機(jī)制中最早的機(jī)制之一。高葡萄糖(HG)在體外或體內(nèi)均可誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷和

3、數(shù)目的減少。文獻(xiàn)報(bào)道，高血糖或者氧化應(yīng)激產(chǎn)物(ROS)增加可能是糖尿病腎病中足細(xì)胞損傷和凋亡的觸發(fā)因素。然而，高血糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制尚未被完全闡明。因此，目前也尚無理想的干預(yù)措施來防治DN患者的足細(xì)胞凋亡。
　　 活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)是一類Ca2+/鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin，CaN)依賴的轉(zhuǎn)錄因子，包括NFAT1、NFAT2、NFA

4、T3、NFAT4及NFAT5共5個(gè)亞型。人們最初發(fā)現(xiàn)NFAT的表達(dá)在免疫細(xì)胞的免疫應(yīng)答中對細(xì)胞因子的基因和其他基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮舉足輕重的作用;隨后發(fā)現(xiàn)它們也存在于機(jī)體的非免疫細(xì)胞中并發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。NFAT不僅在調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長、增殖生理過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用:例如調(diào)節(jié)心臟瓣膜的發(fā)育、骨骼肌和平滑肌細(xì)胞的分化以及血管的發(fā)育。同時(shí)，NFAT的過度活化也可導(dǎo)致心肌及骨骼肌細(xì)胞的病理性肥大。
　　 NFAT的活化高度依賴于Ca

5、2+/CaN，而環(huán)孢素A(cyclosporine A，CSA)可以有效地抑制CaN。正常情況下，NFAT以高度磷酸化的形式存在于胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到某種刺激導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流增加時(shí)，通過激活鈣調(diào)磷酸酶，隨之引起NFATc去磷酸化并轉(zhuǎn)移入核，NFAT的蛋白單獨(dú)或與其他核伙伴組合形成NFATc轉(zhuǎn)錄絡(luò)合物來控制靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮相應(yīng)的生理或病理作用。
　　 近期相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道:高葡萄糖可激活血管平滑肌細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞的NFAT。也有文獻(xiàn)

6、報(bào)道:NFAT的過度活化可導(dǎo)致幾種類型細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，最近有研究還表明，NFAT的過度活化參與了足細(xì)胞損傷和腎小球硬化，但是目前未見關(guān)于高血糖是否可激活腎小球足細(xì)胞的NFAT2并進(jìn)而導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡的報(bào)道。本研究旨在探討高葡萄糖是否能活化體外培養(yǎng)足細(xì)胞的NFAT2和活化的NFAT2在高葡萄糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡中所發(fā)揮的作用;同時(shí)觀察NFAT2活化是否對足細(xì)胞中的促凋亡因子Bax的表達(dá)產(chǎn)生影響并由此促進(jìn)細(xì)胞的凋亡;最后觀察高葡萄糖對足細(xì)胞C

7、a2+內(nèi)流的影響情況。初步探討DN腎小球足細(xì)胞損傷的機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 一、足細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定及實(shí)驗(yàn)分組
　　 （一）足細(xì)胞培養(yǎng):條件永生性小鼠足細(xì)胞由Baylor醫(yī)學(xué)院Danesh教授惠贈。首先在5％CO2，33℃培養(yǎng)箱環(huán)境，用含20-100U·mL-1 IFN-γ的RPMI1640和10％ FBS放入Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)瓶中共孵育，使其獲得增殖能力。然后轉(zhuǎn)入5％CO2，37℃培養(yǎng)箱，用不含IFN-γ的

8、DMEM加5％ FBS共孵育，經(jīng)10-14天的培養(yǎng)誘導(dǎo)，足細(xì)胞進(jìn)入分化階段并最終分化成熟。
　　 （二）足細(xì)胞鑒定及形態(tài)學(xué)觀察:分別對33℃含IFN-γ培養(yǎng)及37℃不含IFN-γ培養(yǎng)10-14天分化成熟后的足細(xì)胞在相差顯微鏡下直接拍片，觀察其形態(tài)學(xué)差異;表達(dá)足細(xì)胞骨架蛋白synaptopodin的細(xì)胞為分化成熟的足細(xì)胞，未分化的足細(xì)胞不表達(dá)synaptopodin蛋白。
　　 （三）按以下不同目的進(jìn)行分組干預(yù)處理足細(xì)胞:

9、
　　 1、不同糖濃度干預(yù)下足細(xì)胞核中NFAT2的表達(dá)情況
　　 1)正常糖組予Glucose5.3 mM干預(yù)2h;
　　 2)高糖組分別予Glucose10 mM、Glucose20 mM、Glucose30 mM和Glucose40 mM干預(yù)2h。
　　 2、不同作用時(shí)間下足細(xì)胞核中NFAT2的表達(dá)情況
　　 1) Glucose5.3 mM分別作用0.5 h、1h、2h和4 h;
　　

10、 2) Glucose20 mM分別作用0.5 h、1h、2h和4h。
　　 3、不同干預(yù)下足細(xì)胞核中NFAT2的表達(dá)情況
　　 1) Glucose5.3 mM作用2h;
　　 2) Glucose20m M作用2h;
　　 3) Glucose5.3 mM+Mannitol14.7 mM作用2h;
　　 4) Glucose20 mM+11R-vivit100nM作用2h;
　　 5

11、) Glucose20 mM+CsA500 nM作用2h;
　　 6) Glucose20 mM+體積0.1％ DMSO作用2h;
　　 7) Glucose5.3 mM+Ionomycin500 nM作用2h。
　　 4、不同干預(yù)下足細(xì)胞的凋亡
　　 1) Glucose5.3 mM作用12h;
　　 2) Glucose5.3 mM作用24 h;
　　 3) Glucose5.3 mM

12、作用48 h;
　　 4) Glucose20 mM作用12h;
　　 5) Glucose20 mM作用24 h;
　　 6) Glucose20 mM作用48 h;
　　 7) Glucose20 mM+11R-vivit100 nM作用48 h;
　　 8) Glucose5.3 mM+Mannitol14.7 mM作用48 h。
　　 5、不同干預(yù)下足細(xì)胞的促凋亡因子Bax的表達(dá)情

13、況
　　 1) Glucose5.3 mM作用24 h;
　　 2) Glucose20 mM作用24 h;
　　 3) Glucose5.3 mM+Mannitol14.7 mM作用24 h;
　　 4) Glucose20mM+11R-vivit100 nM作用24 h;
　　 5) Glucose5.3 mM作用48 h;
　　 6) Glucose20 mM作用48 h;
　

14、　 7) Glucose5.3 mM+Mannitol14.7 mM作用48 h;
　　 8) Glucose20 mM+11R-vivit100 nM作用48 h。
　　 6、不同干預(yù)下足細(xì)胞Ca2+內(nèi)流的變化情況
　　 1) Glucose5.3 mM作用5 min;
　　 2) Glucose20 mM作用5 min;
　　 3) Glucose5.3 mM+Mannitol14.7 mM

15、作用5 min;
　　 4) Glucose5.3 mM+Ionomycin500 nM作用5 min。
　　 二、NFAT2的活化、足細(xì)胞凋亡、Bax的表達(dá)和Ca2+內(nèi)流的情況
　　 分別用免疫熒光、Western blot檢測NFAT2的活化;流式細(xì)胞術(shù)檢測足細(xì)胞的凋亡;實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測Bax表達(dá);采用熒光染料法，用激光共聚焦動態(tài)觀察足細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的變化。
　　 三、

16、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法，方差齊性用LSD法進(jìn)行組間多重比較，方差不齊用Dunnett's T3法進(jìn)行組間多重比較。P＜0.05被定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 一、葡萄糖呈濃度依賴活化NFAT2
　　 Glucose5.3 mM、Glucose10 mM、Glucose20

17、 mM、Glucose30 mM及Glucose40 mM各自作用足細(xì)胞2h，Western blot檢測結(jié)果顯示足細(xì)胞核中NFAT2/Histone3的比值分別為0.999±0.001;1.652±0.188;2.405±0.281;1.850±0.397及2.000±0.381。高糖系列組與Glucose5.3 mM組比較，足細(xì)胞胞核中的NFAT2均有增加，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P5.3mM組,10mM組=0.020;P5.3mM組

18、，20mM組＜0.001;P5.3mM組，30 mM組=0.005;P5.3mM組，40 mM組=0.002);在相同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)，葡萄糖對足細(xì)胞NFAT2表達(dá)的影響呈濃度依賴;當(dāng)應(yīng)用葡萄糖濃度為20 mM的培養(yǎng)基培養(yǎng)2h時(shí)，NFAT2的活化達(dá)到高峰。
　　 二、高濃度葡萄糖呈時(shí)間依賴活化NFAT2
　　 Glucose5.3 mM(NG)分別作用足細(xì)胞0.5 h、1h、2h和4h，western blot顯示NFAT2/

19、Histone3結(jié)果分別為:1.000±0.000;1.080±0.321、1.229±0.385及1.112±0.458;各組兩兩對比，其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P NG0.5h組，NG1h組=0.792;P NG0.5h組,NG2h組=0.455;P NG0.5h組，NG4h組=0.713;P NG1h組，NG2h組=0.626;P NG1h組，NG4h組=0.916;及P NG2h組,NG4h組=0.701）;Glucose20 mM

20、(HG)分別作用足細(xì)胞0.5 h、1h、2h和4h，western blot顯示NFAT2/Histone3結(jié)果分別為:1.253±0.332、1.656±0.464、2.080±0.319及1.601±0.431;其中HG0.5h組與HG1h組對比，其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PHG0.5h組，HG1h組=0.197），HG0.5h組與HG2h組對比，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P HG0.5h組，HG2h組=0.014），HG2h組與HG4h

21、組對比，其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P HG2h組，HG4h組=0.128)。由此推測:在高濃度葡萄糖的培養(yǎng)基中，足細(xì)胞NFAT2表達(dá)的呈時(shí)間依賴;當(dāng)應(yīng)用葡萄糖濃度為20 mM的培養(yǎng)基培養(yǎng)2h時(shí)，NFAT2的活化達(dá)到高峰。
　　 三、不同干預(yù)下NFAT2的活化情況及熒光表達(dá)情況
　　 Western blot檢測顯示足細(xì)胞核中NFAT2/Histone3的比值:Glucose20 mM2 h(HG)組為2.039±0.373

22、;與Glucose5.3 mM+Ionomycin500 nM2 h組（2.353±0.506）結(jié)果相近，兩組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P HG組，Ionomycin組=0.220）;Glucose20 mM+11R-vivit100 nM2 h組與Glucose20 mM+CsA500 nM2 h組分別為:1.223±0.188、1.208±0.207，比Glucose20 mM2 h組明顯減少，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P11R-vivit

23、組，HG組=0.005;PCsA組, HG組=0.004），與Glucose5.3 mM2h(NG)組（1.000±0.000）相近，其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P11R-vivit組,NG組=0.378;P CsA組, NG組=0.409）;Glucose5.3 mM+Mannitol14.7 mM（滲透壓對照）組為:1.173±0.194，與Glucose5.3 mM2 h組相近，其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P滲透壓對照組，NG組=0.49

24、1）。由此推測:高濃度葡萄糖通過不依賴增加滲透壓的途徑活化足細(xì)胞的NFAT2，使用CsA抑制CaN或者11R-vivit均可明顯減少高糖誘導(dǎo)的NFAT2的活化。
　　 應(yīng)用激光共聚焦觀察不同干預(yù)下足細(xì)胞胞核的NFAT2定性表達(dá)情況，NFAT2著染為紅色，細(xì)胞核著染為藍(lán)色，兩種顏色重疊為紫色。NG組、滲透壓對照組、11R-vivit組及CsA組的NFAT2均以表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)為主，胞核區(qū)僅有少量表達(dá);而HG組、DMSO組及Ionomy

25、cin組的NFAT2不僅在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，還高表達(dá)于細(xì)胞的胞核中。其變化與Western blot檢測結(jié)果相似。
　　 四、不同干預(yù)對足細(xì)胞凋亡的影響
　　 使用流式細(xì)胞儀，應(yīng)用Annexin V/PI試劑盒檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。將Annexin V(+)/PI(-)定為凋亡細(xì)胞，結(jié)果顯示:Glucose5.3 mM作用足細(xì)胞12 h、24 h、48 h，各組的凋亡率分別為:（10.00±2.04）％、(11.39±1.

26、62)％及（12.99±2.22）％; Glucose20 mM作用足細(xì)胞12h、24 h、48 h，各組的凋亡率分別為:（11.79±3.24）％、（15.08±3.35）％及（22.72±6.68）％;但是Glucose5.3 mM+Mannitol14.7 mM作用足細(xì)胞48 h，其凋亡率為（13.17±5.36）％，與Glucose5.3 mM48h組相近，其差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P滲透壓對照組，NG組=0.174);而Gluc

27、ose20 mM+11R-vivit100 nM48h組足細(xì)胞的凋亡率為（13.62±3.82）％，比Glucose20mM組明顯減少，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P11R-vivit組，HG48h組＜0.001）。由此推測:高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡呈時(shí)間依賴性，但這一過程不依賴于滲透壓的升高，且通過抑制NFAT2的過度活化，可減少高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。
　　 五、高糖增加Bax的表達(dá)
　　 Bax因子是細(xì)胞中的促凋亡因子。實(shí)時(shí)定量

28、PCR和Western blot分析結(jié)果表明:Glucose20mM48h組，足細(xì)胞中Bax因子的mRNA和蛋白表達(dá)對比Glucose5.3mM48h組均顯著增加（P HG48h組, NG48h組＜0.01，P HG48h組, NG48h組＜0.01）;但是Glucose5.3 mM+Mannitol14.7 mM48h組與Glucose5.3 mM48h組結(jié)果相似;而Glucose20 mM+11R-vivit100 nM48h組較G

29、lucose20mM48h組明顯減少(PHG48h組，11R-vivit48h組＜0.01，P HG48h組，11R-vivit48h組＜0.01)也與Glucose5.3 mM48h組相似。這與細(xì)胞凋亡的結(jié)果相符合。
　　 六、高糖增加足細(xì)胞中鈣離子的濃度
　　 應(yīng)用Fluo-3/AM標(biāo)記Ca2+，激光共焦顯微鏡掃描不同刺激下足細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。結(jié)果表明:Glucose20 mM組、Glucose5.3 mM+

30、Ionomycin500 nM組較Glucose5.3 mM組鈣離子內(nèi)流隨刺激時(shí)間延長均明顯增加;但Glucose5.3mM+Mannitol14.7 mM組鈣離子內(nèi)流與Glucose5.3 mM組相似。由此推測，濃度為20mM的葡萄糖可增加體外培養(yǎng)足細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流，且該過程不依賴于滲透壓的增加。
　　 結(jié)論：
　　 高糖可能通過CaN/NFAT2/Bax信號通路介導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡，阻斷CaN/NFAT2/Bax信號通路