Notch信號(hào)通路在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中的研究.pdf

1、目的:
　　 糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥，是引起終末期慢性腎功能衰竭的主要原因之一。DN的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，糖脂代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)改變、氧化應(yīng)激反應(yīng)及多種細(xì)胞因子等是其主要起始因素。在這些起始因素的下游，又有多條信號(hào)傳導(dǎo)通路在其中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路在DN的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。
　　 已有研究表明，Notch通路決定胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖

2、和分化，在胚胎后腎形成過(guò)程中對(duì)足細(xì)胞和腎小管的分化中起著重要的作用。近年來(lái)在腎臟疾病領(lǐng)域的研究證實(shí)，Notch信號(hào)通路與糖尿病腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化、腎病綜合癥等多種腎小球疾病有關(guān)，參與腎小球硬化的發(fā)生。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)Notch信號(hào)通路有四種受體和五種配體，其中受體為Notch1-Notch4，配體分別為Jagged1、Jagged2、Delta樣配體(Dll)1、Dll3和Dll4。配體與Notch受體的結(jié)合導(dǎo)致受體構(gòu)象發(fā)生改變，

3、隨后在γ-分泌酶(γ-secretase)的介導(dǎo)下發(fā)生蛋白水解作用，釋放出Notch胞內(nèi)域（Notchintracellulardomain，NICD），NICD轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，活化Hes1和Hey1等分化拮抗基因的轉(zhuǎn)錄，阻礙分化效應(yīng)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的分化、增殖和凋亡。
　　 既往研究認(rèn)為，DN的主要病理特征是腎小球基底膜(glomerularbasementmembrane,GBM)增厚、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellul

4、armatrix，ECM)堆積、腎小球硬化、腎小管萎縮及腎間質(zhì)纖維化。近年研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞損傷在DN發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。足細(xì)胞是終末分化的腎小球上皮細(xì)胞，它附著在GBM外側(cè)，是腎小球?yàn)V過(guò)膜的重要組成部分。由于足細(xì)胞是高度分化細(xì)胞，增殖能力較差，當(dāng)足細(xì)胞受到損傷時(shí)，Nephrin和Podocin等足細(xì)胞相關(guān)蛋白在足細(xì)胞裂孔膜(slitdiaphragm，SD)丟失，使腎小球?yàn)V過(guò)電荷屏障減弱，促進(jìn)蛋白尿的發(fā)生。足盂蛋白(podoca

5、lyxin，PCX)是足突頂膜區(qū)主要的帶負(fù)電荷跨膜蛋白，當(dāng)足細(xì)胞損傷后PCX表達(dá)減少，破壞了足突間的排斥作用使之發(fā)生粘附、融合，導(dǎo)致足細(xì)胞易于脫落?，F(xiàn)已知主要的凋亡通路有Bcl-2、p53、NF-κB等，在DN發(fā)生時(shí)，足細(xì)胞內(nèi)的這些凋亡通路可被激活，誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。同時(shí)受損的足細(xì)胞對(duì)ECM生成的調(diào)節(jié)作用發(fā)生紊亂，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)等促進(jìn)基質(zhì)生成的因素增加，造成Ⅳ型膠原

6、等基膜樣基質(zhì)增加，導(dǎo)致腎小球硬化，加速DN的進(jìn)展。
　　 許多學(xué)者通過(guò)不同方法證實(shí)了Notch信號(hào)通路在足細(xì)胞分化中的作用，Cheng等使用γ-分泌酶抑制劑(γ-secretaseinhibitor，GSI)抑制小鼠后腎形成過(guò)程中Notch通路的活化，發(fā)現(xiàn)近端小管細(xì)胞和腎小球中足細(xì)胞的形成明顯減少，而伴隨非上皮細(xì)胞的增多。如果在足細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)異常Notch通路的活化，可抑制足細(xì)胞的終末分化，引起小鼠腎小球硬化。我們通過(guò)收集

7、臨床糖尿病腎病標(biāo)本、建立糖尿病小鼠模型及足細(xì)胞高糖(highglucose，HG)培養(yǎng)，檢測(cè)Notch信號(hào)通路家族成員(Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1及Hey1)的表達(dá)情況，并通過(guò)應(yīng)用血管緊張素Ⅱ1受體阻斷劑(angiotensinⅡtype1receptorantagonism，AT1Ra)、基因干擾技術(shù)及Notch信號(hào)通路抑制劑(GSI)抑制Notch通路，來(lái)觀察是否Notch信號(hào)通路參與DN時(shí)的足細(xì)胞損傷，促進(jìn)

8、足細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，為糖尿病腎病的治療提供一條新的思路。
　　 方法:
　　 1、糖尿病腎病患者腎組織中Notch信號(hào)通路檢測(cè)
　　 收集2010年10月～2012年10月在河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院經(jīng)病史、臨床檢查及腎穿刺活檢病理診斷為糖尿病腎病患者34例(diabeticnephropathygroup)，既往無(wú)其它腎臟病史，以10例腎腫瘤患者遠(yuǎn)離腫瘤的瘤旁組織做為對(duì)照組（controlgroup）。留取血

9、和尿標(biāo)本檢測(cè)血糖(Glu)、糖化血紅蛋白(HbA1)、24小時(shí)尿蛋白定量（UPE）、肌酐(Scr)、估算腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR);采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1及Hey1蛋白表達(dá)。
　　 2、Notch信號(hào)通路在糖尿病小鼠腎組織中的作用
　　 雄性CD-1小鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組（controlgroup）、糖尿病組（diabeticgroup）、糖尿病+纈沙坦組（diabetic

10、+Valsartangroup）。糖尿病模型小鼠腹腔單次注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，150mg/kg)，對(duì)照組只注射相同體積的枸櫞酸鹽緩沖液，72小時(shí)后測(cè)定血糖和尿糖，血糖值≥16.7mmol/L，尿糖值+++～++++者確定為糖尿病模型成功。糖尿病+纈沙坦組小鼠在糖尿病模型建立后，以纈沙坦(40mg/kg)灌胃，對(duì)照組和糖尿病組以等體積蒸餾水灌胃。分別于成模后1、2、4、8周每組取6只小鼠，收集血液及24小時(shí)

11、尿液，用于生化指標(biāo)檢測(cè)，ELISA方法檢測(cè)尿液PCX的含量;切取腎臟4％中性甲醛固定用于組織化學(xué)、TUNEL及免疫組織化學(xué)染色;取部分腎皮質(zhì)組織置于4％戊二醛用于電鏡觀察;部分腎皮質(zhì)組織用于提取蛋白及RNA，Westernblot檢測(cè)Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1、Hey1、Bax、Bcl-2、cleavedCaspase-3、p-p53及p53蛋白表達(dá)，Real-timePCR檢測(cè)Jagged1、Notch1、He

12、s1及Hey1mRNA表達(dá);另取部分腎皮質(zhì)組織于70％酒精固定，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　 3、高糖對(duì)小鼠足細(xì)胞Notch信號(hào)通路的作用
　　 小鼠足細(xì)胞在5％CO2，33℃CO2培養(yǎng)箱中，以含有10％胎牛血清及γ-干擾素(10U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞使其增殖，傳代后更換為不含γ-干擾素的RPMI1640培養(yǎng)液，置入5％CO2，37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14天，促進(jìn)細(xì)胞分化成熟。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

13、分成7組:正常糖對(duì)照組（5.5mmol/Lglucose，NG）、正常糖+高滲對(duì)照組(5.5mmol/Lglucose+24.5mmol/Lmannitol,NM)、高糖組(30mmol/Lglucose,HG)、高糖+陰性質(zhì)粒組（30mmol/Lglucose+sh-Scramble，HG+C）、高糖+sh-Jagged1質(zhì)粒組（30mmol/Lglucose+sh-Jagged1，HG+J1）、高糖+sh-Notch1質(zhì)粒組(30m

14、mol/Lglucose+sh-Notch1，HG+N1)、高糖+GSI組(30mmol/Lglucose+1μmol/LGSI，HG+GSI)。分別經(jīng)細(xì)胞同步化、分組干預(yù)刺激0、12、24、48、72小時(shí)后收集細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1和Hey1蛋白表達(dá);Westernblot檢測(cè)Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1、Hey1、Bax、Bcl-2、cleavedCaspase

15、-3、p-p53及p53蛋白表達(dá);Real-timePCR檢測(cè)Jagged1、Notch1、Hes1及Hey1mRNA表達(dá);TUNEL和AnnexinV/PI染色檢測(cè)足細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)果:
　　 1、糖尿病腎病患者臨床病理表現(xiàn)及Notch信號(hào)通路檢測(cè)
　　 ①光鏡下觀察，對(duì)照組腎小球、腎小管及腎間質(zhì)未見(jiàn)明顯異常;糖尿病腎病組腎小球體積增大，基底膜彌漫或不規(guī)則增厚，細(xì)胞外基質(zhì)增多，K-W結(jié)節(jié)形成，部分腎小管上

16、皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，間質(zhì)纖維化。②糖尿病腎病組空腹血糖、糖化血紅蛋白、尿蛋白量、肌酐較對(duì)照組均明顯增多，而腎小球?yàn)V過(guò)率糖尿病腎病組患者比對(duì)照組下降。③免疫組化顯示Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1及Hey1在腎小球及腎小管均有表達(dá)，糖尿病腎病組較對(duì)照組表達(dá)增多。
　　 2、糖尿病小鼠腎組織Notch信號(hào)通路的表達(dá)及纈沙坦對(duì)Notch信號(hào)通路和足細(xì)胞損傷的影響
　　 ①光鏡及電鏡下觀察，糖尿病組小鼠輕微腎小

17、球體積增大，系膜基質(zhì)增多，基底膜不規(guī)則增厚，足細(xì)胞數(shù)量減少，足突融合，部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性。②與對(duì)照組相比，糖尿病組小鼠尿蛋白(Upro)從2周開(kāi)始明顯升高，隨病程延長(zhǎng)呈逐漸升高的趨勢(shì);糖尿病小鼠血糖(Glu)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)比對(duì)照組小鼠增加，隨病程延長(zhǎng)呈逐漸升高的趨勢(shì);與對(duì)照組相比，糖尿病組小鼠尿蛋白和尿PCX含量明顯升高，給予纈沙坦治療后尿蛋白和PCX含量降低。③免疫組化結(jié)果顯示Jagged1、Notch

18、1、NICD1、Hes1和Hey1在對(duì)照組腎小球及腎小管有少量表達(dá)，在糖尿病組表達(dá)明顯增加;Westernblot檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，糖尿病組小鼠腎組織中Jagged1、NICD1、Hes1及Hey1從1周時(shí)開(kāi)始升高，表達(dá)最高點(diǎn)在4周，8周時(shí)略有下降;Notch1蛋白在糖尿病組比對(duì)照組表達(dá)增加，在糖尿病組各周次間表達(dá)無(wú)明顯差異;糖尿病組Jagged1、Notch1、Hes1和Hey1mRNA水平與對(duì)照組相比表達(dá)增加，最高點(diǎn)在2周，隨

19、后下降。④Westernblot和Real-timePCR顯示，糖尿病組小鼠腎小球組織Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1和Hey1蛋白及Jagged1、Notch1、Hes1和Hey1mRNA水平與對(duì)照組相比增加，給予纈沙坦治療后降低。⑤TUNEL染色顯示在糖尿病組小鼠腎組織中觀察到凋亡細(xì)胞;Bax、p-p53及cleavedCaspase-3蛋白在糖尿病組小鼠腎小球組織中表達(dá)比對(duì)照組增加，給予纈沙坦治療后降低;Bcl-

20、2蛋白表達(dá)水平糖尿病組較對(duì)照組降低，給予纈沙坦后表達(dá)升高;p53蛋白在各組間表達(dá)無(wú)明顯差異;流式細(xì)胞術(shù)顯示糖尿病組小鼠腎小球內(nèi)細(xì)胞凋亡增加，糖尿病+纈沙坦組降低，但仍高于對(duì)照組。
　　 3、足細(xì)胞體外高糖培養(yǎng)對(duì)Notch信號(hào)通路表達(dá)及足細(xì)胞損傷的影響
　　 ①免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，Jagged1、Notch1、NICD1、Hes1和Hey1在正常糖對(duì)照組足細(xì)胞中有少量表達(dá)，給予高糖刺激后表達(dá)量明顯增加;Westernblot

21、檢測(cè)顯示，Jagged1和NICD1蛋白在高糖刺激足細(xì)胞12小時(shí)升高，48小時(shí)表達(dá)最高，72小時(shí)略有下降;Notch1蛋白在高糖刺激后其它時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量是高糖刺激0小時(shí)表達(dá)量的2倍，高糖刺激12～72小時(shí)足細(xì)胞中Notch1蛋白水平表達(dá)無(wú)明顯差異;Hes1蛋白在高糖刺激24小時(shí)升高，48小時(shí)達(dá)到項(xiàng)點(diǎn)，72小時(shí)有所降低;Hey1表達(dá)在高糖刺激12和24小時(shí)升高，然后隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)下降;高糖刺激呈時(shí)間依賴性引起Jagged1、Notc

22、h1和Hes1mRNA升高，最高峰在48小時(shí);Hey1mRNA最高點(diǎn)在高糖刺激24小時(shí)，隨后隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)而下降。②Westernblot和Real-timePCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高糖刺激引起Jaggedl、Notch1、NICD1、Hes1、Hey1蛋白及Jagged1、Notch1、Hes1、Hey1mRNA表達(dá)增加，sh-Jagged1和sh-Notch1轉(zhuǎn)染足細(xì)胞后表達(dá)下降，GSI可抑制足細(xì)胞NICD1、Hes1、Hey1蛋白及He

23、s1、Hey1mRNA在高糖刺激后的過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，但Jagged1、Notch1蛋白及mRNA在高糖+GSI組和高糖組之間無(wú)明顯差異。③Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高糖呈時(shí)間依賴性刺激Bax蛋白表達(dá)，12小時(shí)開(kāi)始增加，72小時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，而B(niǎo)cl-2蛋白在高糖刺激后表達(dá)逐漸下降，最低點(diǎn)在72小時(shí);cleavedCaspase-3在高糖刺激12小時(shí)開(kāi)始增加，24小時(shí)為最高點(diǎn)，之后逐漸減少;p-p53蛋白在高糖刺激下表達(dá)逐漸增加，最高點(diǎn)在7

24、2小時(shí);p53蛋白在高糖刺激各時(shí)間點(diǎn)之間表達(dá)無(wú)明顯差異。④足細(xì)胞高糖培養(yǎng)并應(yīng)用GSI或sh-Jagged1、sh-Notch1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)Bax、p-p53及cleavedCaspase-3蛋白較高糖組表達(dá)下降，但較正常糖對(duì)照組表達(dá)仍高，而B(niǎo)cl-2蛋白較高糖組表達(dá)增強(qiáng)，但較正常糖對(duì)照組表達(dá)仍低，p53蛋白在各組間表達(dá)無(wú)明顯差異。⑤TUNEL熒光染色及AnnexinV/PI染色顯示高糖組較正常糖對(duì)照組細(xì)胞凋亡率升高，轉(zhuǎn)染組及高糖+GS

25、I組細(xì)胞凋亡率比高糖組降低。
　　 結(jié)論:
　　 1、在糖尿病腎病患者腎組織、糖尿病小鼠腎組織、高糖培養(yǎng)足細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路成員有過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，提示Notch通路在糖尿病腎病足細(xì)胞中激活并可能參與足細(xì)胞損傷過(guò)程。
　　 2、纈沙坦抑制糖尿病小鼠腎組織中Notch信號(hào)通路的活化，同時(shí)抑制蛋白尿和足細(xì)胞脫落，抑制凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，抑制腎小球內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)沉積。提示纈沙坦可通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路