Rac1信號通路在糖尿病腎病足細胞損傷中的作用研究.pdf

1、背景:
　　Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate1，Rac1)是Rho家族小G蛋白成員之一，在細胞粘附，增殖以及細胞骨架調(diào)節(jié)等一系列細胞生理活動中發(fā)揮重要作用。過度激活的Rac1參與氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)等病理過程，與糖尿病腎病的發(fā)病及病情發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，在一定損傷下足細胞可能通過上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymaltr

2、ansition，EMT)這一機制發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致足細胞結(jié)構(gòu)與功能紊亂、腎小球濾過膜的破壞以及蛋白尿的發(fā)生。而Rac1可能通過活化p21活化激酶1(p21-activated kinase1，PAK1)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated proteinkinase，MAPK)等下游重要的效應(yīng)激酶參與腫瘤細胞EMT過程。P38 MAPK為MAPK家族成員之一，參與產(chǎn)生炎癥介質(zhì)及調(diào)節(jié)細胞骨架穩(wěn)定性。本課題組前期研究發(fā)

3、現(xiàn)，高糖環(huán)境可通過激活p38 MAPK誘導(dǎo)腎小管上皮細胞發(fā)生EMT，參與糖尿病腎病腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展，而靶向p38MAPK的重組質(zhì)粒可有效干擾p38MAPK基因表達，阻斷EMT的發(fā)生。因此，本研究以條件永生化小鼠足細胞系及構(gòu)建足細胞特異性Rac1 RNAi轉(zhuǎn)基因小鼠(transgenic mice，TG mice)作為研究對象，觀察并探討Rac1/PAK1/p38 MAPK信號通路的激活在高糖刺激誘導(dǎo)的足細胞EMT及糖尿病腎病蛋白尿發(fā)

4、生過程中的作用機制，Rac1信號通路與EMT中重要轉(zhuǎn)錄因子β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的相互關(guān)系，以及靶向抑制足細胞Rac1活性水平對糖尿病腎病足細胞損傷以及蛋白尿的保護作用，為臨床早期預(yù)防和治療糖尿病腎病提供新的理論依據(jù)和新的思路。
　　第一部分 Rac1在高糖誘導(dǎo)的足細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用機制
　　目的:
　　1.明確高糖環(huán)境是否導(dǎo)致足細胞發(fā)生EMT。
　　2.明確足細胞發(fā)生EMT是否導(dǎo)致其功能

5、障礙，影響其屏障功能。
　　3.探討Rac1信號通路參與高糖誘導(dǎo)的足細胞EMT的發(fā)生機制。
　　4.探討調(diào)控Rac1信號通路對高糖誘導(dǎo)的足細胞EMT的影響。
　　方法:
　　1.細胞培養(yǎng):體外培養(yǎng)永生化小鼠足細胞系（由哈佛醫(yī)學(xué)院Peter Mundel教授惠贈，北京大學(xué)丁潔教授轉(zhuǎn)贈）。在Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)，在條件下，用RPMI1640（10％胎牛血清）+10 U/ml重組小鼠γ-干擾素，于33℃培養(yǎng)足細胞增殖

6、;用不含γ-干擾素培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)足細胞14天促進其分化成熟。
　　2.檢測高糖(30mmol/l)刺激前后足細胞EMT指標(biāo)及足細胞功能:(1)倒置相差顯微鏡明確足細胞形態(tài)學(xué)是否變化;(2) western blot、real time PCR及細胞免疫熒光檢測足細胞標(biāo)志蛋白p-cadherin、ZO-1及間充質(zhì)細胞樣表型標(biāo)志物FSP-1、α-SMA、desmin的表達變化;(3)流式細胞術(shù)檢測高糖培養(yǎng)條件下足細胞凋亡情況;(4)

7、 Transwell小室檢測白蛋白流入量，評價足細胞的單層屏障功能;(5) Transwell檢測足細胞遷移率以及FITC-鬼筆環(huán)肽(FITC-phailoidin)染色鑒定足細胞F-actin細胞骨架變化。
　　3.Rac1/PAK1/p38 MAPK信號通路檢測:(1) Rac1 shRNA載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及基因敲低效率的鑒定:①熒光顯微鏡觀察陽性轉(zhuǎn)染率;②western blot及realtime PCR檢測轉(zhuǎn)染前后足細胞Ra

8、c1蛋白及mRNA表達水平;(2)抑制劑IPA-3及SB203580的配制:將粉末試劑溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配制成儲存液，保存于-20℃。用于處理細胞時，首先以DMSO進一步稀釋，然后計算加入體積確保培養(yǎng)基內(nèi)抑制劑終濃度為10μM;(3) GST Pull-down assay檢測Rac1活性;(4) western blot檢測不同處理組足細胞內(nèi)PAK1及p38 MAPK磷酸化水平。
　

9、　4.檢測調(diào)控Rac1信號通路對足細胞EMT及功能的影響:(1)檢測調(diào)控Rac1信號通路后足細胞EMT指標(biāo)及功能變化;(2) western blot、細胞免疫熒光等檢測不同處理組轉(zhuǎn)錄因子β-catenin、Snail表達水平變化。(3)明確Rac1信號通路與β-catenin的相互作用:①構(gòu)建激活型Rac1(CA-Rac1)、野生型Rac1(WT-Rac1)、失活型Rac1(DN-Rac1)三種Rac1表達質(zhì)粒;②構(gòu)建β-cateni

10、n表達質(zhì)粒(Flag-β-catenin)以及空對照質(zhì)粒;③共轉(zhuǎn)染Rac1表達質(zhì)粒與β-catenin表達質(zhì)粒;④免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，CO-IP）檢測Rac1/PAK1與β-catenin的相互作用;⑤體外激酶實驗(in vito kinase assay)檢測p38 MAPK與β-catenin之間的相互作用。
　　結(jié)果:
　　1.高糖培養(yǎng)48小時后標(biāo)志性蛋白p-cadherin和ZO

11、-1表達明顯減少（P＜0.01）而間充質(zhì)樣蛋白FSP-1、α-SMA及desmin出現(xiàn)重新表達（P＜0.01）;Transwell小室白蛋白流入量顯著增加（P＜0.01），同時F-actin骨架蛋白出現(xiàn)明顯的邊集現(xiàn)象，伴隨足細胞遷移率顯著增高（P＜0.01）。
　　2.高糖刺激48小時導(dǎo)致了Rac1蛋白的激活(P＜0.01)，以及PAK1、p38MAPK磷酸化水平的增高（P＜0.01）;同時引起β-catenin的N端去磷酸化、S

12、nail表達增加（P＜0.05），以及β-catenin細胞核遷移。
　　3.Rac1 shRNA顯著抑制了足細胞EMT指標(biāo)的發(fā)生(P＜0.05)，部分修正了足細胞功能損傷(P＜0.05);同時明顯減少了PAK1、p38 MAPK磷酸化水平(P＜0.05)，降低了轉(zhuǎn)錄因子β-catenin、Snail活性（P＜0.05），并部分阻斷了β-catenin核遷移;抑制劑IPA-3及SB203580對Rac1活性均無顯著影響（P＞0.0

13、5），且SB203580對PAK1磷酸化無抑制作用（P＞0.05）。
　　4.Rac1對β-catenin的C端絲氨酸位點具有直接磷酸化修飾作用，這一作用導(dǎo)致β-catenin泛素化水平降低;同時，p38 MAPK通過磷酸化下游信號分子MEF2c來結(jié)合β-catenin。
　　結(jié)論:
　　1.高糖導(dǎo)致足細胞發(fā)生EMT及功能障礙。
　　2.Rac1通過激活下游信號分子PAK1/p38 MAPK參與高糖誘導(dǎo)的足細胞E

14、MT。
　　3.高糖條件下Rac1/PAK1/p38 MAPK信號通路通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子β-catenin活性與遷移，影響EMT相關(guān)基因及蛋白表達，從而導(dǎo)致足細胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化。
　　4.調(diào)控Rac1/PAK1/p38 MAPK信號通路可阻斷足細胞EMT的發(fā)生
　　第二部分足細胞特異性Rac1 RNAi轉(zhuǎn)基因小鼠的建立與鑒定
　　目的:
　　構(gòu)建與鑒定足細胞特異性Rac1 RNAi TG小鼠。
　　方法

15、:
　　1.構(gòu)建足細胞特異性Rac1 shRNA載體:(1) PCR擴增Nephrin啟動子及mirRac1序列;(2)利用酶切連接構(gòu)建pUp-Nephrin和pDown-SM30/mirRac1;(3)利用gateway technology構(gòu)建pLV.EX2d.null-Nephrin＞SM30/mirRac1表達質(zhì)粒。
　　2.獲得足細胞特異的Rac1 RNAi TG小鼠:(1)建立F0小鼠:①利用酶切將載體進行DNA

16、線性化并提純;②通過DNA顯微注射受精卵獲取新生小鼠;③基因分型PCR鑒定陽性者為已整合外源基因的TG小鼠F0;(2) F0小鼠與C57BL/6野生型小鼠雜交與傳代，鼠尾DNA提取及基因分型PCR篩選實驗用TG小鼠。
　　3.靶向敲低Rac1效率鑒定:(1)免疫熒光雙標(biāo)法檢測Rac1、synaptopodin在野生型(wide type，WT)與TG小鼠腎臟組織中的表達;(2) western blot及real time PCR

17、檢測WT和TG小鼠原代足細胞中Rac1的表達。
　　結(jié)果:
　　1.獲得鼠尾DNA PCR產(chǎn)物陽性的足細胞特異TG小鼠。
　　2.Rac1蛋白在TG小鼠腎臟組織中表達明顯少于WT小鼠，而synaptopodin的表達不受外源基因整合的影響。
　　3.TG小鼠原代足細胞中Rac1蛋白和mRNA水平較WT小鼠顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建足細胞特異性Rac1 RNAi TG小鼠。

18、r>　　第三部分靶向抑制Rac1信號通路對糖尿病腎病足細胞損傷的保護作用
　　目的:
　　1.構(gòu)建野生型以及Rac1 RNAi轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠模型。
　　2.探討足細胞靶向抑制Rac1對糖尿病腎病足細胞損傷的保護作用。
　　3.探討足細胞靶向抑制Rac1對糖尿病腎病蛋白尿及腎臟的保護作用。
　　方法:
　　1.建立WT和TG糖尿病小鼠模型:(1)以鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(W

19、T-STZ/TG-STZ)，或無菌檸檬酸緩沖液進行腹腔注射作為對照(WT-control/TG-control);(2)鼠尾靜脈采血測定血糖＞16.7mmol即為造模成功。
　　2.造模成功后4W-12W檢測指標(biāo):體重、收縮壓、血糖、24h尿蛋白定量等。
　　3.糖尿病腎臟病變檢測:(1)透射電鏡測定足細胞數(shù)、足突融合率以及基底膜的平均厚度變異情況;(2)免疫熒光雙標(biāo)法或免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistr

20、y，IHC)測定足細胞裂孔膜(slit diaphragm，SD)蛋白p-cadherin和ZO-1，間充質(zhì)樣蛋白FSP-1、α-SMA、desmin及基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases，mmp9)的表達變化;(3) PAS染色觀察腎組織病理改變;(4) IHC檢測WT-1蛋白表達及足細胞凋亡情況。
　　4.GST pull-down檢測原代足細胞中Rac1蛋白活性;western blot檢測P

21、AK1及p38 MAPK磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　　1.WT-STZ小鼠6W時電鏡示足細胞出現(xiàn)足突輕度融合;免疫熒光雙標(biāo)顯示SD蛋白p-cadherin和ZO-1表達開始降低，desmin表達增加;原代足細胞中Rac1蛋白活性顯著提高，PAK1與p38 MAPK磷酸化水平增加（P＜0.01）;8W時出現(xiàn)mmp9表達及蛋白尿（P＜0.05）;12W時足突明顯融合，mmp9表達及蛋白尿水平明顯加重（P＜0.01），同時出現(xiàn)FS

22、P-1重新表達。
　　2.各觀察時間段內(nèi)WT-STZ組體重分別較WT-control組顯著下降（P＜0.01）;4W-8W時TG-STZ組較WT-STZ組體重有所上升（P＜0.05）。
　　3.電鏡顯示各觀察時間段內(nèi)TG-STZ組均較WT-STZ組足突融合減輕;免疫熒光提示足細胞標(biāo)志指標(biāo)p-cadherin及ZO-1表達水平回升;desmin，mmp9與FSP-1明顯減少。
　　4.6W時TG-STZ較WT-STZ原代

23、足細胞GTP-Rac1表達減少，同時PAK1與p38 MAPK磷酸化水平顯著減少（P＜0.05）。
　　5.各觀察時間段TG-STZ組均較WT-STZ組蛋白尿顯著減少（P＜0.05），同時PAS示腎小球基底膜(glomerular basement membrane，，GBM)與系膜區(qū)病變程度降低。
　　6.各觀察時間段TG-STZ與WT-STZ小鼠血糖血壓無顯著差別(P＞0.05);四組組間足細胞數(shù)量無顯著差異（P＞0.0