MiR-182靶向基因Rac1調(diào)控糖尿病心肌病變的研究.pdf

1、目的：探討Rac1參與調(diào)控糖尿病心肌病變的上游機制，揭示miRNA在糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展中的作用，為糖尿病心肌病發(fā)病機制及臨床治療的研究提供新視角。
　　方法：第一部分利用生物信息學方法預(yù)測調(diào)控 Rac1的候選 miRNAs。在糖尿病組db/db小鼠及對照組db/m小鼠的心肌組織中驗證所有候選miRN As的表達;并將糖尿病組小鼠心肌中差異表達的miRNAs與Rac1進行Pearson相關(guān)性分析，篩選出與Rac1呈最強負相關(guān)的mi

2、RNA。
　　第二部分原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，通過高糖處理心肌細胞，用real-time RT-PCR技術(shù)進一步驗證Rac1、所選 miRNA的表達情況。通過轉(zhuǎn)染所選 miRNA的模擬物進行干預(yù)，實驗分為4組：正常糖組（5mM），高糖組（33 mM），正常糖+所選miRNA模擬物組，高糖+所選miRNA模擬物組。通過real-time RT-PCR技術(shù)及Western blot技術(shù)分別檢測各組心肌細胞Rac1、β-MHC、α-SMA

3、的mRNA及蛋白表達情況。
　　第三部分8周齡雄性C57/BL-6J小鼠隨機分為正常對照組（n=5），miR-182模擬物對照組（n=5），STZ型糖尿病組（n=15），STZ型糖尿病+所選miRNA模擬物治療組（n=15）。向C57/BL-6J小鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（S TZ）建立STZ型糖尿病動物模型。8周后實驗達終點時，記錄小鼠的體重及血糖情況；采用小動物用高分辨超聲儀檢測各組小鼠心臟功能；通過 HE染色觀察心肌細胞大

4、小，通過Masson染色觀察心肌纖維化程度；運用透射電鏡觀察小鼠心肌組織的超微結(jié)構(gòu)；利用real-time RT-PCR技術(shù)檢測心肌組織β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)，α-肌球蛋白重鏈(α-MHC)，心房鈉尿肽(ANP)，I型膠原(Col I)和III型膠原(Col III) mRNA，待測mRNA及Rac1的表達情況。
　　結(jié)果：第一部分通過生物信息學方法，預(yù)測到參與調(diào)控Rac1的候選miRNAs共6個：分別是miR-182、m

5、iR-142-3p、miR-140、miR-101a、miR-429、miR-200b。與db/m組比較，db/db組糖尿病小鼠心肌組織中miR-142-3p、miR-182的表達顯著下調(diào)，具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。Pearso n相關(guān)性分析顯示miR-182與Rac1表達水平的負相關(guān)最顯著，r值為-0.89102。
　　第二部分體外實驗顯示高糖誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞肥大時，miR-182表達明顯降低，而Rac1表達明顯升高，兩者

6、之間亦呈負相關(guān)。與正常糖組比較，高糖組心肌細胞肥大明顯。與高糖組相比，高糖+miR-182模擬物組心肌細胞肥大程度明顯降低。RT-PCR及Western blot結(jié)果均顯示與高糖組相比，高糖+miR-182模擬物組心肌細胞Rac1及β-MHC的表達均降低，具有統(tǒng)計學意義（p<0.05），但α-SMA的表達降低不具有統(tǒng)計學意義。
　　第三部分超聲心動圖檢測顯示：與糖尿病組相比，糖尿病+miR-182模擬物組小鼠的左室射血分數(shù)及左室短

7、軸縮短率明顯升高，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示：與糖尿病組比較，糖尿病+miR-182模擬物組小鼠心肌組織中Rac1、ANP、Col I、Col III mRNA的表達及β/α-MHC比值明顯下降，具有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　HE染色結(jié)果顯示：正常對照組及miR-182模擬物對照組心肌細胞排列規(guī)則整齊，細胞核大小均一；而糖尿病組小鼠心肌排列紊亂，心肌肥大明顯，細胞核增大，形態(tài)不規(guī)則；糖尿病+miR

8、-182組小鼠心肌肥大程度減低，心肌排列較規(guī)則。Masso n染色后心肌纖維呈現(xiàn)為深紅色而心臟間質(zhì)膠原呈現(xiàn)為深藍色：正常對照組及 miR-182模擬物對照組小鼠心肌間質(zhì)膠原纖維較少且均勻分布；而糖尿病組小鼠心肌組織膠原纖維明顯增多聚集，分布紊亂不均勻；糖尿病+miR-182組小鼠心肌膠原纖維較糖尿病組明顯減少。
　　透射電鏡結(jié)果顯示：正常對照組及 miR-182模擬物對照組小鼠心肌纖維排列整齊有序，肌小節(jié)及明帶暗帶清晰可見，線粒體

9、大小均一，呈圓形或橢圓形沿心肌纖維整齊排列；糖尿病組小鼠心肌纖維排列紊亂，肌絲扭曲、斷裂，心肌線粒體明顯異型增大及增多聚集，線粒體可腫脹、嵴消失甚至溶解，可見糖原顆粒及脂滴增多聚集，心臟間質(zhì)大量膠原纖維聚集，可見較多自噬體；而糖尿病+miR-182模擬物組小鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷較糖尿病組明顯減輕。
　　結(jié)論：（1）利用生物信息學方法預(yù)測、通過動物模型體內(nèi)實驗及Pearso n相關(guān)性分析，最終篩選得出Rac1的候選miRNA為 mi

10、R-182；同時體外實驗進一步驗證心肌細胞中miR-182與Rac1表達呈負相關(guān)。
　?。?）M iR-182模擬物降低高糖誘導(dǎo)心肌細胞中Rac1的表達，減輕高糖誘導(dǎo)心肌細胞的肥大程度，降低心肌細胞肥大相關(guān)表型的表達。
　　（3）MiR-182可參與糖尿病心肌病的調(diào)控，miR-182模擬物能可減輕糖尿病小鼠心肌組織Rac1表達，改善糖尿病小鼠心臟收縮功能，這與其降低糖尿病小鼠心肌肥大及心肌纖維化程度，減輕糖尿病小鼠心肌超微結(jié)