ACE2基因轉(zhuǎn)染對(duì)糖尿病心肌病大鼠心功能的影響.pdf

1、隨著糖尿病發(fā)病率的逐年上升，其并發(fā)的糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)也同益受到人們的重視。越來(lái)越多證據(jù)表明，糖尿病心肌病是一個(gè)獨(dú)立的、特異的心肌疾病無(wú)其他通常導(dǎo)致心功能減退的誘因如高血壓、冠心病、瓣膜病、先天性心臟病等，也無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化的證據(jù)。1974年，Hamby等首次提出了糖尿病心肌病的概念，并認(rèn)為糖尿病心肌病變與糖尿病特有的代謝異常有關(guān)。其臨床特征早期以心臟舒張功能不全、晚期以收縮功能不全為

2、主，容易發(fā)生充血性心力衰竭。 DCM的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system．RAS)激活、能量代謝紊亂、微血管微循環(huán)障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)異常、自主神經(jīng)功能紊亂等多個(gè)因素，其中心肌細(xì)胞肥大及纖維化是DCM最重要的病理改變之一，而腎素一血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在這一病理改變中發(fā)揮重要作用。 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-2(Angiotensin-converting enzyme2，AC

3、E2)是2000年發(fā)現(xiàn)的腎素-血管緊張素系(RAS)新成員，與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE)是同系物，兩者的金屬蛋白酶催化區(qū)有42％是一致的。ACE2主要分布于心臟和腎臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞、冠狀動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞等部位。在功能上，與ACE不同，ACE2能水解血管緊張素Ⅰ(angiotensinⅠ，AngⅠ)將其轉(zhuǎn)換為Ang(1-9)，并進(jìn)一步在ACE或其他肽酶水解下生成Ang(1-7)

4、；或者直接水解血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)，生成Ang(1-7)，研究證實(shí)ACE2是AngⅡ水解的主要途徑，而且Ang(1-7)是其主要產(chǎn)物。AngⅡ是目前公認(rèn)的促心肌纖維化因素，可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，導(dǎo)致心肌纖維化，心室順應(yīng)性下降，最終致心室收縮及舒張功能不全。Ang(1—7)作為一種心血管保護(hù)性多肽，具有舒張血管、抗生長(zhǎng)和抗增殖的作用。為此我們擬在DCM動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染使ACE2過(guò)表

5、達(dá)，降解AngⅡ，減少膠原合成，從而改善心功能。 目的： 1．構(gòu)建DCM動(dòng)物模型； 2．觀察ACE2基因轉(zhuǎn)染后心肌ACE2的表達(dá)； 3．研究腺病毒為載體的ACE2基因轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠糖尿病心肌病的治療作用，并探討其可能的機(jī)制。 方法： 72只體重為200-220g雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為模型組(n=64只)和正常對(duì)照組(n=8只)，模型組大鼠腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(STZ)65mg/kg，正

6、常對(duì)照組大鼠注射等量檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖液。大鼠成糖尿病標(biāo)準(zhǔn)為：連續(xù)2次空腹血糖≥16.7mmol/L。血糖升高后，繼續(xù)喂養(yǎng)12周，最終共60只大鼠成為糖尿病心肌病。將糖尿病心肌病大鼠隨機(jī)平均分為三個(gè)組：ACE2組心肌注射攜帶ACE2基因的重組腺病毒100μl(1×109pfu)；EGFP組心肌注射空載重組腺病毒即增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)100μl(1×109p

7、fu)；DCM組心肌注射無(wú)菌生理鹽水100μl?；蜣D(zhuǎn)染后10天，糖尿病心肌病各組隨機(jī)取8只大鼠處死，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、免疫印跡(Western blot)檢測(cè)ACE2基因的表達(dá)；基因轉(zhuǎn)染前及實(shí)驗(yàn)?zāi)?，超聲心?dòng)圖檢測(cè)左室收縮末內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter，LVESD)、左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、射血

8、分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)，E/A比值；實(shí)驗(yàn)組織病理學(xué)檢查，常規(guī)HE染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)，Masson染色觀察心肌組織膠原分布并定量分析，ELISA檢測(cè)心肌AngⅡ含量；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，監(jiān)測(cè)大鼠體重及空腹血糖。 結(jié)果： 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中4只大鼠死亡，2只未達(dá)DCM標(biāo)準(zhǔn)予以剔除，最終共66

9、只大鼠完成實(shí)驗(yàn)，其中正常對(duì)照組8只，DCM19只，EGFP組19只，ACE2組20只。 2．各組動(dòng)物體重及血糖測(cè)定：STZ注射后1周，與正常對(duì)照組相比，DCM大鼠體重?zé)o顯著差異(p>0.05)，空腹血糖明顯升高(p<0.01)；實(shí)驗(yàn)?zāi)?，與正常對(duì)照組相比，其它3組大鼠體重明顯下降(p<0.01)，空腹血糖仍明顯升高(p<0.01)。 3．實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果：ACE2組ACE2mRNA的表達(dá)明顯高于DCM組(p<0.

10、05)和EGFP組(p<0.05)；DCM組與EGFP組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 4．Western blot檢測(cè)ACE2蛋白表達(dá)：ACEE2組ACE2蛋白的表達(dá)明顯高于DCM組(P<0.01)和EGFP組(P<0.01)；DCM組與EGFP組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。 5．超聲心動(dòng)圖檢測(cè)：基因轉(zhuǎn)染前，與對(duì)照組相比，DCM大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)(包括LVESD、LVEDD、LVEF、FS、E/A比值

11、)均有差異(P<0.01)，DCM各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。實(shí)驗(yàn)?zāi)?，與DCM組、EGFP組相比，ACE2組以上各指標(biāo)均有好轉(zhuǎn)(P<0.05)。 6．心肌組織病理學(xué)檢查：HE染色切片上，正常對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核大小均一，胞漿染色均勻：DCM組、EGFP組心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核大小不甚規(guī)則，可見肌纖維斷裂、排列紊亂；ACE2組較DCM組、EGFP組明顯好轉(zhuǎn)，心肌細(xì)胞排列較規(guī)整，肌纖維斷裂少見，細(xì)胞核較規(guī)則

12、。 7．Masson三色染色：心肌細(xì)胞染色呈紅色，間質(zhì)膠原呈藍(lán)綠色，紅細(xì)胞呈橘黃色。正常對(duì)照組心肌膠原組織分布均勻；DCM組、EGFP組心肌間質(zhì)膠原纖維明顯增多，圍繞心肌細(xì)胞的膠原纖維斷裂、排列紊亂；ACE2組較DCM組心肌間質(zhì)膠原纖維明顯減少，相鄰細(xì)胞的膠原纖維排列整齊。定量分析顯示，與正常對(duì)照組相比，DCM組、EGFP組心肌組織膠原含量明顯高(P<0.01)；與DCM組和EGFP組相比，ACE2組心肌組織膠原明顯降低(P<0

13、.01)。 8．心肌AngⅡ檢測(cè)：與正常對(duì)照組相比，DCM組、EGFP組心肌AngⅡ含量明顯高(P<0.01)；與DCM組相比，ACE2組心肌AngⅡ含量明顯減少(P<0.01)。 結(jié)論： 1．通過(guò)腹腔注射STZ并喂養(yǎng)12個(gè)周，成功建立了糖尿病性心肌病大鼠模型，為DCM發(fā)病機(jī)制的研究提供了可靠的平臺(tái)； 2．基因轉(zhuǎn)染后，ACE2組大鼠ACE2mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高。 3．ACE2基因轉(zhuǎn)染后，