脂質對糖尿病腎病損傷作用的機制研究.pdf

1、第一部分食餌性高脂血癥對STZ誘導糖尿病SD大鼠腎臟損害作用和對腎臟TGF-β1、TpRⅡ、p-Smad2和ColⅣ表達的影響目的：觀察食餌性高脂血癥對STZ誘導的糖尿病SD大鼠腎臟損害作用和高脂血癥對糖尿病SD大鼠腎臟皮質轉化生長因子-β1 、(TGF-β1)、轉化生長因子-βⅡ型受體(TβRⅡ)、磷酸化Smad2 、(p-Smad2)和Ⅳ型膠原(ColⅣ)表達的影響，初步探討脂質對DN腎臟損傷的作用機制。 方法：STZ腹腔注

2、射法誘導SD大鼠糖尿病成模。采用正常飲食和高脂飲食分別喂養(yǎng)糖尿病SD大鼠和非糖尿病SD大鼠16 周；每4周尾靜脈取血監(jiān)測大鼠血糖、血總膽固醇、甘油三酯 水平的變化；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測不同飲食喂養(yǎng)16周后大鼠24h尿白蛋白水平；自動生化儀檢測血肌酐、尿素氮、血總膽固醇、甘油三酯；過碘酸-雪夫染色(PAS染色)觀察大鼠腎小球細胞外基質(ECM)的沉積；采用半定量逆轉錄 PCR(RT-PCR)檢測各組大鼠腎臟皮質TGF-β1

3、、TβRⅡ和ColⅣmRNA表達的變化；免疫組織化學染色檢測各組大鼠腎小 球TβRⅡ和p-Smad2的表達和定位；Westem-blot檢測各組大鼠腎皮質TGF-βp1和ColⅣ蛋白表達變化。 結果： 1．高脂飲食喂養(yǎng)4周后糖尿病SD大鼠出現(xiàn)血總固醇、甘油三酯顯著升高，并持續(xù)到試驗的終點。但高脂飲食喂養(yǎng)的非糖尿病SD大鼠12周后才出現(xiàn)血總固醇、甘油三酯升高。 2．糖尿病大鼠24h尿白蛋白水平高于非糖尿病SD大

4、鼠，肌酐和尿素氮有一定升高但無統(tǒng)計學意義。高脂飲食喂養(yǎng)16周后糖尿病大鼠24h尿白蛋白、血肌酐和尿素氮水平明顯升高(與正常飲食喂養(yǎng)的糖尿病SD大鼠比較，P值均小于0.01)。高脂飲食喂養(yǎng)對非糖尿病SD大鼠尿白蛋白、血肌酐和尿素氮無影響(與正常飲食喂 養(yǎng)的非糖尿病SD大鼠比較，P值均大于0.05)。 3．高脂飲食喂養(yǎng)的糖尿病大鼠腎小球出現(xiàn)明顯的ECM沉積，而高脂喂養(yǎng)16周對非糖尿病SD大鼠腎小球ECM合成的影響不明顯。

5、4．RT-PCR證實：與非糖尿病SD大鼠比較，糖尿病SD大鼠腎臟皮 質TFGF-β1、TpRII和Col Ⅳ mRNA表達上調(與正常飲食喂養(yǎng) 的非糖尿病SD大鼠比較，P值均小于0.01)，高脂飲食喂養(yǎng)進一 步上調糖尿病SD大鼠腎臟皮質TFGF-β1、TβRII和ColⅣ mRNA(與正常飲食喂養(yǎng)的糖尿病SD大鼠比較，P值均小于 0.01)。 5．免疫組織化學染色證實：TpR II陽性染色主要定位于腎小球細胞 細胞膜

6、。高脂和正常飲食喂養(yǎng)的非糖尿病SD大鼠僅少量腎小球細 胞呈現(xiàn)TβRII陽性染色，兩者TβRII染色陽性率分別為16％ 和18％(P>0．05)。正常飲食喂養(yǎng)的糖尿病SD大鼠腎小球TβRII 染色陽性細胞增加，而高脂喂養(yǎng)的糖尿病SD大鼠腎小球TβRII 染色陽性細胞增加更加明顯，兩者TβRII染色陽性率分別39％ 和61％(P<0.01)。磷酸化Smad2陽性染色定位于細胞核和周邊。 正常飲食和高脂飲食喂養(yǎng)的非糖尿病SD大鼠p

7、-Smad2染色陽性 的腎小球細胞很少見。正常飲食喂養(yǎng)的糖尿病SD大鼠少量腎小球 細胞呈現(xiàn)p-Smad2陽性染色，而高脂喂養(yǎng)的糖尿病SD大鼠腎小 球細胞p-Smad2陽性染色增加，正常飲食喂養(yǎng)的糖尿病SD和高 脂喂養(yǎng)的糖尿病SD大鼠腎小球細胞p-Smad2染色陽性率分別為 15％和32％(P<0.01)。 6．Westem-blot證實：高脂喂養(yǎng)上調糖尿病SD大鼠腎臟皮質TGF-β1 和CollⅣ蛋白表達水平(與正常

8、飲食喂養(yǎng)的糖尿病SD大鼠比 較，P值均小于0.01)，高脂喂養(yǎng)對非糖尿病SD大鼠腎臟皮質 TrGF-p1和ColⅣ蛋白表達無明顯影響(與正常飲食喂養(yǎng)的非糖尿 病SD大鼠比較，P值均大于0.05)。 結論： 1．食餌性高脂血癥導致STZ誘導的糖尿病SD大鼠腎臟功能和結 構的損害。 2．糖尿病狀態(tài)下，SD大鼠腎臟皮質TGF-β1、TβRII、p-Smad2和 ColⅣ的表達上調，食餌性高脂血癥能進一步上調糖

9、尿病SD大 鼠腎臟皮質TGF-β1、TβR II、p—Smad2和CollⅣ的表達。高脂、 血癥可能通過增加TGF-β系統(tǒng)和Smad蛋白的生物活性介導糖 尿病腎臟損害。 第二部分溶血卵磷脂對腎小球系膜細胞Col IV合成的影響 目的：通過研究脂質成分溶血卵磷脂(LPC)對人腎小球系膜細胞(HMCs)內TGF-β／Smad信號通路及其下游靶基因Col IV影響，進一步探討脂質引起腎臟損傷的分子機制。 方法：

10、 1．融合后的HMCs分成10μM LPC刺激0、2h、6h、12h、24h， 48h組。采用免疫組化檢測p-Smad2核內遷移，Westem-blot檢測 不同時間點P-Smad2和ColIV蛋白表達水平。 2．融合后的HMCs分成對照組與LPC刺激組。LPC刺激12h后， 采用ELISA法檢測上清液TGF-β1蛋白含量。 3．融合后的HMCs分成對照組與LPC刺激組、LPC刺激+51μg／ml TGF-

11、β1中和抗體組、LPC刺激+51μg／ml IgG(與TGF-β1中和抗 體同源)組。干預12h后檢測p-Smad2蛋白表達水平以及在細胞 內的遷移，干預24h后檢測Col IV蛋白表達水平。 4．寡核苷酸轉染HMCs，采用RT-PCR和Westem Blot檢測寡核苷 酸對HMCs內Smad mRNA和蛋白表達的影響。 5．HMCs和轉染寡核苷酸的HMCs分成對照組和LPC刺激組、LPC 刺激+Smad2反義寡

12、核苷酸轉染組和LPC刺激+錯義寡核苷 酸轉染組。LPC干預24h后Westem-blot檢測各組Col IV蛋白 表達7k平。 結果： 1．LPC呈時間依賴性激活腎小球系膜細胞Smad蛋白，10gM LPC刺激2h后，Smad2磷酸化水平增加，6h達到高峰，24h后Smad活性不再增加。LPC刺激后，免疫組織化學染色顯示p-Smad2向細胞核內遷移增加， Western-blot顯示p-Smad2和Coliv蛋白表

13、達水平上調。 2．LPC刺激12h后，系膜細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1蛋白含量增加。LPC刺激組上清液中TGF-β1蛋白含量為85±7.4 pg／ml，對照組上清液中TGF-β1蛋白含量為34±6.3 pg／ml(P<0.01)。 3．TGF-β1中和性抗體能阻斷LPC刺激引起的HMCs內Col IV 蛋白的合成；TGF-β1同源的IgG對LPC刺激引起的HMCS 內Col IV蛋白合成無明顯抑制作用。4．Sm