高糖刺激對足細(xì)胞表型及GSK3β活性的影響.pdf

1、背景：糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是導(dǎo)致終末期腎臟病的重要原因,是威脅糖尿病患者生命健康的嚴(yán)重并發(fā)癥。蛋白尿是DN最常見的臨床表現(xiàn),與DN的嚴(yán)重程度及病情進(jìn)展密切相關(guān)。近年來,腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)和功能的改變,尤其足細(xì)胞損傷在DN蛋白尿發(fā)生發(fā)展中的作用,已成為了眾多學(xué)者關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。
　　 足細(xì)胞貼覆于腎小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)的外壁,是一種

2、高度分化的特殊的上皮細(xì)胞,對維持腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)和功能的完整性發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在某些刺激物的作用下,足細(xì)胞可發(fā)生上皮—間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),喪失足細(xì)胞特異性表型標(biāo)志物,造成足細(xì)胞功能紊亂,最終導(dǎo)致腎小球?yàn)V過功能缺失。目前研究認(rèn)為,主要有三條信號通路介導(dǎo)了足細(xì)胞EMT,即TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-catenin通路,糖原合成酶激酶

3、3β(glycogen synthase kinase3β,GSK3β)作為以上多條信號通路的參與者,可能在足細(xì)胞EMT過程中發(fā)揮了重要的作用。
　　 目的：
　　 通過觀察高糖刺激下小鼠足細(xì)胞是否發(fā)生表型的改變,以及GSK3β的表達(dá)量和活性的變化,探討足細(xì)胞損傷參與DN蛋白尿形成的可能機(jī)制及GSK3β在該過程中的作用,為DN的治療尋找新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。
　　 方法：以條件永生化小鼠足細(xì)胞(MPC-5)為研究對

4、象。
　　 1.高糖刺激對足細(xì)胞表型的影響:
　　 (1)不同濃度葡萄糖對足細(xì)胞表型的影響:用含不同濃度葡萄糖(12.5、25、50mmol/L)的1640培養(yǎng)基處理細(xì)胞36h,并設(shè)正常對照組(5.6 mmol/L葡萄糖)和高滲對照組(5.6 mmol/L葡萄糖+44.4 mmol/L甘露醇),采用Western Blot與RT-PCR的方法分別從蛋白及mRNA水平檢測足細(xì)胞表型標(biāo)志物nephrin和問充質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志物

5、α-SMA的表達(dá);
　　 (2)高糖刺激不同時間對足細(xì)胞表型的影響:用含25 mmol/L葡萄糖的1640培養(yǎng)基處理細(xì)胞,采用Western Blot與RT-PCR的方法分別從蛋白及mRNA水平檢測不同時間點(diǎn)(0h、12h、24h、36h、48h)足細(xì)胞nephrin和α-SMA的表達(dá)。
　　 2.高糖刺激對足細(xì)胞GSK3β活性的影響及其與EMT的關(guān)系:
　　 按以下方法分組:①正常對照組:用含5.6 mmol/

6、L葡萄糖的1640培養(yǎng)基處理細(xì)胞;②高糖組:用含25 mmol/L葡萄糖的1640培養(yǎng)基處理細(xì)胞;③高滲對照組:用含5.6 mmol/L葡萄糖+19.4 mmol/L甘露醇的1640培養(yǎng)基處理細(xì)胞;④高糖+氯化鋰(LiCl)組:用含25mmol/L葡萄糖+20 mmol/L氯化鋰(鋰離子可選擇性抑制GSK3β的活性)的1640培養(yǎng)基處理細(xì)胞,36h后采用Western Blot的方法從蛋白水平檢測各組細(xì)胞nephrin、α-SMA、總G

7、SK3β以及9位絲氨酸位點(diǎn)(抑制位點(diǎn))磷酸化的GSK3β(pSer9-GSK3β)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.Western Blot與RT-PCR結(jié)果均顯示:(1)正常對照組和高滲對照組足細(xì)胞表達(dá)nephrin,僅少量表達(dá)α-SMA,而予不同濃度葡萄糖處理36h后,nephrin的表達(dá)水平隨葡萄糖濃度的升高呈劑量依賴性下調(diào)(P＜0.05),α-SMA的表達(dá)水平隨葡萄糖濃度的升高呈劑量依賴性上調(diào)(P＜0.05):(

8、2)高糖環(huán)境下足細(xì)胞nephrin的表達(dá)水平隨高糖作用時間的延長呈時間依賴性下調(diào)(P＜0.05),α-SMA的表達(dá)水平隨作用時間的延長呈時間依賴性上調(diào)(P＜0.05)。
　　 2.Western Blot結(jié)果顯示:正常對照組、高糖組、高滲對照組及高糖+氯化鋰組足細(xì)胞總GSK3β的表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。與對照組相比,高糖組足細(xì)胞nephrin表達(dá)減少,α-SMA表達(dá)增多,pSer9-GSK3β表達(dá)減少(即GSK3β活化

9、),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);高糖環(huán)境下,用氯化鋰抑制GSK3β活性后,足細(xì)胞pSerg-GSKβp表達(dá)增多,但nephrin表達(dá)的減少及α-SMA表達(dá)的增多較高糖組反而更加明顯,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.在高糖刺激下,足細(xì)胞發(fā)生向間充質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)分化,且nephrin和α-SMA在蛋白及mRNA表達(dá)水平的改變呈劑量和時間依賴性。
　　 2.用氯化鋰抑制GSK3