GSK-3β在高糖環(huán)境下足細胞轉(zhuǎn)分化效應中的作用.pdf

1、背景：
　　 糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病患者最常見的微血管并發(fā)癥之一，也是導致終末期腎臟病(end-stagerenaldisease，ESRD)的重要原因。蛋白尿是DN最常見的臨床表現(xiàn)，也是糖尿病腎病進展的獨立危險因素，因此減少蛋白尿是糖尿病腎病治療的重要舉措。足細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，其結構和功能的改變在DN蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了關鍵的作用。足細胞參與蛋白尿形成的原

2、因很多，機制復雜。作為一種終末分化的臟層上皮細胞，足細胞在某些刺激物的作用下可通過特定程序向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)，但足細胞在高糖環(huán)境下是否發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化以及足細胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化是否參與蛋白尿的形成尚不清楚。
　　 目前研究認為，有三條信號通路介導了足細胞的轉(zhuǎn)分化過程，即TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-catenin，而廣泛存

3、在于真核生物體內(nèi)的糖原合成酶激酶3β(glycogensynthasekinase3β，GSK-3β)是以上三條通路的參與者，但其是否參與高糖環(huán)境下足細胞的轉(zhuǎn)分化目前尚不明確。
　　 無機離子鋰（本課題使用氯化鋰）是一種治療狂躁和抑郁癥的藥物，是GSK-3β的選擇性活性抑制劑，通過鋰的作用，抑制高糖環(huán)境下GSK-3β的活性，并觀察足細胞表型和功能的變化，或許能為糖尿病腎病蛋白尿?qū)ふ倚碌闹委煱悬c。
　　 目的：
　　

4、 本實驗通過觀察高糖環(huán)境下小鼠足細胞表型和功能的改變、GSK-3β表達量和活性的改變、以及抑制GSK-3β活性和表達量后足細胞表型和功能的變化，來研究GSK-3β在高糖環(huán)境下足細胞轉(zhuǎn)分化效應中的作用，并為糖尿病腎病蛋白尿的治療尋找新的靶點。
　　 方法：
　　 以條件永生化小鼠足細胞為研究對象。
　　 1.高糖環(huán)境下檢測足細胞表型和功能:
　　 (1)不同濃度葡萄糖對足細胞表型的影響:用含不同濃度葡萄糖

5、(12.5、25、50mmol/L)的1640培養(yǎng)基處理足細胞36h，并設正常對照組(5.6mmol/L葡萄糖)和高滲對照組（5.6mmol/L葡萄糖+44.4mmol/L甘露醇），采用Western-blot與間接免疫熒光的方法檢測足細胞表面標記蛋白nephrin，podocin和間充質(zhì)細胞表型標志物α-SMA，F(xiàn)ibronectin的表達;
　　 (2)不同濃度葡萄糖刺激足細胞36h后白蛋白流入量的變化:將分化成熟的足細胞以

6、一定密度(5×103)接種于transwell小室上層的聚酯纖維膜上，待細胞融合后，換無血清培養(yǎng)基饑餓8小時，然后使用含不同濃度葡萄糖(5.6、12.5、25、50mmol/L)的1640培養(yǎng)基處理足細胞36小時，36h后使用滅菌PBS洗滌細胞兩次，然后給Transwell濾過膜的上部換上0.3ml的RPMI1640培養(yǎng)基，下部充滿1ml含40mg/ml胎牛血清白蛋白的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃孵育1小時后，取上層培養(yǎng)液，用BCA

7、蛋白濃度測定試劑盒測定濾過膜上部培養(yǎng)基的白蛋白濃度，即白蛋白流入量。
　　 2.高糖環(huán)境下足細胞GSK-3β表達量及活性的變化:
　　 (1)不同濃度葡萄糖(5.6、12.5、25、50mmol/LGlu)處理足細胞36h后，用Western-blot檢測GSK-3β及其9位絲氨酸位點pSer9GSK-3β（抑制位點）的表達量以及216位酪氨酸位點pTyr216GSK-3β（活化位點）的表達量;
　　 (2)不同

8、糖濃度處理的足細胞GSK-3β活性的變化:足細胞按上述濃度分組培養(yǎng)36h后，按照GSK-3β活性檢測試劑盒（GenmedScientific，美國）說明書處理足細胞，依次加入各種試劑，于分光光度計上檢測各組樣品的OD值，按試劑盒說明書給出的公式計算GSK-3β的活性。
　　 3.應用siRNA干擾GSK-3β后檢測足細胞表型及功能:
　　 根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫提供的小鼠的GSK-3β全長基因(GeneBankNO.

9、NM-019827.6)由上海吉凱基因化學技術有限公司設計的靶序列mRNA(5'-3')為:CCACTCAAGAACTGTCAAGTA.，陰性對照的siRNA正義鏈(5'-3')序列為:UUCUCCGAACGUGUCACGUtt。應用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000（invitrogen，美國）將GSK-3βsiRNA以30nmol的濃度轉(zhuǎn)染足細胞36小時后檢測各組足細胞nephrin，podocin，α-SMA表達量的變

10、化;同時應用Transwell檢測各組的白蛋白流入量以評估足細胞的單層屏障功能。
　　 4.應用GSK-3β活性抑制劑后足細胞表型及功能的變化
　　 應用LiCl，一種經(jīng)典的GSK-3β活性抑制劑，觀察抑制GSK-3β活性后足細胞表型及功能的變化，或許能為糖尿病腎病蛋白尿的臨床治療提供借鑒。將實驗分為正常糖對照組(5.6mmol/LGlu)，正常糖+LiCl組，高糖組(25mmol/LGlu)、高糖+LiCl組，檢測各組

11、足細胞標記蛋白nephrin，podocin，間充質(zhì)標記蛋白α-SMA，F(xiàn)ibronectin的表達量，并應用Transwell檢測各組足細胞的白蛋白流入量，觀察單層屏障功能的變化。
　　 結果：
　　 1.(1)Western-blot與間接免疫熒光結果均顯示:與高糖組相比，正常糖對照組和高滲對照組足細胞高表達nephrin，podocin，僅少量表達間充質(zhì)蛋白標記物α-SMA，F(xiàn)ibronectin;對Western

12、-blot結果進行灰度分析，發(fā)現(xiàn)nephrin，podocin的蛋白表達水平隨葡萄糖濃度的升高呈劑量依賴性下調(diào)(P＜0.05)，α-SMA的表達水平隨葡萄糖濃度的升高呈劑量依賴性上調(diào)(P＜0.05);(2)用Transwell測不同處理的足細胞白蛋白流入量，評估足細胞的單層屏障功能，發(fā)現(xiàn)與正常糖濃度組相比，高糖組白蛋白流入量增加，且隨葡萄糖濃度的升高呈計量依賴性上調(diào)(P＜0.05)。
　　 2.(1)Western-blot結果

13、顯示，與正常糖及高滲對照組相比，高糖組足細胞GSK-3β表達量增多，pSer9GSK-3β表達量減少，pTyr216GSK-3β表達量增多，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);(2)GSK-3β激酶活性檢測試劑盒顯示，與正常糖相比，經(jīng)高糖處理的足細胞GSK-3β活性增強，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3.應用GSK-3βsiRNA處理足細胞發(fā)現(xiàn)，應用GSK-3βsiRNA處理組與陰性對照組及高糖對照組相比，足細胞表

14、面標記蛋白nephrin，podocin表達量增多，間充質(zhì)標記蛋白α-SMA表達減少;用Transwell檢測各組白蛋白流入量，發(fā)現(xiàn)處理組白蛋白流入量減少，單層屏障功能改善。
　　 4.高糖環(huán)境下，應用GSK-3β活性抑制劑LiCl可以部分逆轉(zhuǎn)足細胞的轉(zhuǎn)分化，改善足細胞的單層屏障功能。
　　 結論：
　　 1.足細胞在高糖環(huán)境下發(fā)生轉(zhuǎn)分化（表型改變與功能受損）。
　　 2.GSK-3β參與高糖環(huán)境下足細胞