GSK-3β在大鼠肝卵圓細胞活化、增殖中作用的研究.pdf

1、研究背景： 糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)在剛發(fā)現(xiàn)的時候只認為僅參與肌肉能量儲存和新陳代謝。但隨著研究的逐步加深，發(fā)現(xiàn)該酶參與多種信號傳導通路調(diào)節(jié)，其靶蛋白包括胞漿蛋白和核轉錄因子，在胚胎發(fā)育、細胞分化、腫瘤形成等多方面發(fā)揮重要作用[1]。迄今，多種GSK-3作用底物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，其中包括糖原合成酶、轉錄起始因子eIf2、熱休克蛋白轉錄因子(HSF21)、蛋白激酶A(PKA)

2、、癌基因(c-Jun、c-Myc、c-myb)、反應結合蛋白(CREB)等[1]。目前，腫瘤的發(fā)病原因尚未弄清，但很多證據(jù)表明在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，有大量信號轉導途徑異常激活或抑制，涉及多種蛋白的異常表達增加或降低，其中GSK-3就是比較重要的一種。目前已知GSK-3家族包括兩個成員，GSK-3α和GSK-3β[2]。 肝臟是功能復雜的消化器官，參與體內(nèi)蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類等生物大分子的代謝、解毒、分泌等重要功能。肝臟器官容易

3、受到不慎攝入的外界有害物質(zhì)的損傷。肝臟具有很強的再生功能，在正常生理狀態(tài)下或輕度肝損時，肝細胞參與增殖和分化，維持肝臟的正常功能。目前已有大量的實驗表明，廣泛和慢性的肝損傷導致肝細胞大量破壞或肝細胞的增殖能力被抑制時，肝組織中可觀察到卵圓細胞的增殖和分化。這種細胞具有肝臟干細胞的特性，可以在一定條件下分化為成熟的肝細胞和膽管細胞，但它未見于正常的成體肝臟中。肝臟干細胞在理論研究和臨床應用都有重要意義。肝臟干細胞可能參與肝臟損傷后的再生和

4、修復，因此其增殖和分化機理的研究有助于闡明肝臟發(fā)育機制。另外，肝臟強大的增殖能力，并可分化為肝細胞，這將為肝衰或肝病時細胞移植、組織工程和基因治療帶來新的希望。 GSK-3β在WNT、NF-κB、SHH、Notch等信號通路中參與重要的作用，而GSK-3β在肝臟干細胞(卵圓細胞)中的研究目前國內(nèi)外尚未見報道，本課題旨在研究GSK-3β在肝臟卵圓細胞活化、增殖中的表達和意義。 目的： 1、建立肝臟卵圓細胞活化、增

5、殖模型。 2、檢測GSK-3β及磷酸化的GSK-3β在肝臟卵圓細胞活化、增殖過程中的表達。 方法： 取健康雄性SD大鼠54只，體重150-180g(溫州醫(yī)學院動物中心提供)，隨機分成2組，每組27只，實驗組(2-AAF/PH組)用玉米油將2-乙酰胺基芴配成1％濃度，通過胃管每日15mg/kg體重灌胃連續(xù)4d，對照組(PH組)同樣單純用玉米油灌胃，同時于第5天停喂，在水合氯醛(10％)麻醉下行肝臟2/3切除。第6天

6、繼續(xù)灌胃。肝臟2/3切除時定為Oh，分別于手術后0h、1h、6h、12h、24h、48h、72h、120h、168h處死動物(每個時間點3只)，并取部分肝臟迅速置入液氮罐中，隨后轉移至-80℃冰箱中，以備提取組織中蛋白。另取一部分入10％福爾馬林液固定，做石蠟包埋切片，HE染色觀察卵圓細胞增生情況，免疫組化檢測OV6，c-kit、PCNA以明確模型建立是否成功，并通過免疫組化檢測GSK-3β及磷酸化的GSK-3β表達。提取各時段肝組織中

7、的蛋白，用于Western blot檢測GSK-3β、磷酸化的GSK-3β以及內(nèi)參β-actin表達，將膠片進行掃描，用Quantity One凝膠圖像分析軟件分析P-Ser9GSK-3β光密度值、總GSK-3β光密度值及β-actin光密度值，得出結論。 結果： 1、肝卵圓細胞活化模型建立：2-AAF/PH大鼠肝切除后第4天開始可見膽管增生反應和膽管周圍的卵圓細胞活化，于第9天最明顯。卵圓細胞增生部位多位于匯管區(qū)及小葉

8、間膽管附近，所見到的肝卵圓細胞體積較小，卵圓細胞核呈卵圓形，胞質(zhì)較少，嗜酸性弱。肝卵圓細胞大小及分布不均勻，呈簇狀分布，且由匯管區(qū)向肝實質(zhì)內(nèi)延伸。免疫組化染色結果顯示，肝卵圓細胞漿OV6染色陽性，c-kit、PCNA也為陽性。 2、免疫組化檢測GSK-3β及磷酸化GSK-3β表達：2-AAF/PH組中的肝臟卵圓細胞細胞核與細胞漿均有表達GSK-3β，磷酸化GSK-3β未見明顯表達。PH組肝細胞見GSK-3β表達于細胞漿。

9、 3、Western blot檢測GSK-3β及磷酸化GSK-3β表達：2-AAF/PH組中肝臟切除前，GSK-3β即有表達，隨后表達量升高，6小時后下降，12小時降至最低點，24小時后開始升高，120小時達到高峰，168小時又開始降低，伴隨著GSK-3β的變化，Ser9GSK-3β在2-AAF/PH組肝切除前便開始磷酸化，12小時后磷酸化最明顯，隨著時間點下降直至消失。 結論： 1、通過2-AAF/PH模型可以成功的建