SD大鼠肝祖-卵圓細(xì)胞GPC3陽性亞群分離與鑒定.pdf

1、目的:建立大鼠肝祖/卵圓細(xì)胞增殖模型，分離并鑒定GPC3陽性卵圓細(xì)胞亞群，為深入探索GPC3對卵圓細(xì)胞癌變作用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.選擇42只體重約150-180g雄性SD大鼠，按隨機原則分為對照組和模型組。采用經(jīng)典2-乙酰氨基芴結(jié)合三分之二肝大部分切除術(shù)(2-acetylamino fluorene/partial hepatectomy，2-AAF/PH)方法建立卵圓細(xì)胞增殖模型，即按15mg/kg劑量灌胃

2、2-AAF4天，次日行三分之二肝大部分切除術(shù)，術(shù)后繼續(xù)以相同劑量2-AAF灌胃1周。
　　2.兩組大鼠在10％水合氯醛腹腔麻醉下于術(shù)后第0d、4d、7d、9d、11d、13d和16d處死后取出肝臟組織，予10％中性福爾馬林固定液固定、常規(guī)石蠟包埋并制成5μm組織切片;各組組織切片行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin stain，HE染色）以觀察不同時間點卵圓細(xì)胞增殖情況;同時，利用卵圓細(xì)胞特異性O(shè)V-6抗

3、體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(Immunohistochemical，IHC)，并在400高倍鏡下對10個不同視野匯管區(qū)進(jìn)行OV-6陽性細(xì)胞計數(shù)，用SPSS13.0軟件包采用多樣本均數(shù)比較的單因素方差分析對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，確定卵圓細(xì)胞增殖高峰時間。
　　3.采用兩步酶消化法結(jié)合Percoll密度梯度離心法于增殖高峰期初步分離卵圓細(xì)胞群，并采用免疫組織及免疫細(xì)胞化學(xué)染色(Immunocytochemical，ICC)的方法鑒定該群

4、細(xì)胞的OV-6、CK19和GPC3的表達(dá)。
　　4.在此基礎(chǔ)上通過間接免疫磁珠分選技術(shù)進(jìn)一步分選GPC3陽性卵圓細(xì)胞亞群。
　　結(jié)果:
　　2-AAF（15 mg/kg）/PH能有效建立SD大鼠卵圓細(xì)胞增殖模型，卵圓細(xì)胞增生灶多集中于匯管區(qū)小葉間膽管處;對照組和術(shù)后第0天無OV-6陽性細(xì)胞，而其他模型組各時間點均可見OV-6陽性細(xì)胞，隨著PH時間的延長，OV-6陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，以術(shù)后第9-11天達(dá)高峰，之后OV-

5、6陽性細(xì)胞數(shù)逐漸減少。同時，兩步酶消化法結(jié)合Percoll密度梯度離心有效分離純化得到離體卵圓細(xì)胞群;該群卵圓細(xì)胞可表達(dá)OV-6、CK19及GPC3三種抗原;在該卵圓細(xì)胞群基礎(chǔ)上通過間接免疫磁珠分選技術(shù)能得到GPC3陽性卵圓細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　1.2-AAF/PH（15mg/kg的2-AAF結(jié)合2/3肝部分切除術(shù)）能成功建立SD大鼠肝祖/卵圓細(xì)胞增殖模型，術(shù)后第9-11天為卵圓細(xì)胞增殖高峰期。
　　2.該模型分離的