大鼠肝臟卵圓細胞的干細胞特性和功能研究.pdf

1、背景：糖尿病(diabetes mellitus ，DM)已經(jīng)成為21 世紀嚴重威脅人類健康的疾病之一，近年來，糖尿病的發(fā)病呈逐年上升趨勢，而且發(fā)病更趨年輕化。目前，胰腺或胰島細胞移植被認為是一種有效根治糖尿病的方法，但是，由于胰腺供體缺乏、胰島細胞數(shù)量有限并且移植存在免疫排斥，需要終身服用免疫抑制劑，限制了其在臨床上的大量應用。干細胞在一定條件下可轉分化為胰島細胞，成為胰島細胞潛在的替代資源。肝臟卵圓細胞(hepatic oval c

2、ells ，HOC)是存在于肝臟的一種具有自我增殖和分化潛能的干細胞，而且肝臟和胰腺在胚胎發(fā)育中均來源于內胚層，在發(fā)生上有密切聯(lián)系，在適當條件下還可轉分化為胰島β 細胞，將這種由自身肝臟卵圓細胞轉分化而來的胰島β 細胞植入糖尿病患者，既可以避免免疫排斥，無需終生服用免疫抑制劑，也為新型胰島的來源開辟了途徑，為糖尿病的臨床治療提供了新思路。目前，體外卵圓細胞培養(yǎng)仍存在所得細胞數(shù)量少，細胞的增殖活性不高，在體外傳代培養(yǎng)過程中干細胞特性保持時

3、間短，易于向肝細胞和膽管細胞分化，細胞轉分化調控機制尚不明確，轉分化條件需要摸索等問題。因此，如何實現(xiàn)在體外大量擴增卵圓細胞并保持其干細胞的生物學特征在肝臟卵圓細胞的轉分化中具有重要意義。本文通過體外細胞傳代培養(yǎng)和體內細胞功能檢測的方法，研究肝臟卵圓細胞在體外傳代培養(yǎng)過程中干細胞特性的表達和保持情況并研究細胞的增殖活性以及在體內高糖環(huán)境下細胞的功能變化。具體包括：㈠體外細胞傳代培養(yǎng)：選用2-乙酰氨基芴（2-acetaminofluore

4、ne ，2-AAF ）灌胃和四氯化碳（CCL4 ）腹腔注射的方法建立肝臟卵圓細胞活化增殖模型，用熒光激活細胞篩選法（Fluorescence-activated cell sorting ，F(xiàn)ACS ）分選細胞，對分選得到的細胞進行體外傳代培養(yǎng)，并對傳代后的細胞進行形態(tài)學鑒定和生化鑒定，目的在于研究肝臟卵圓細胞體外傳代培養(yǎng)過程中干細胞特性的保持情況，為今后肝臟卵圓細胞的體內移植和轉分化奠定良好的基礎；㈡體內細胞功能檢測：采用2-AAF

5、聯(lián)合CCL4 方法建立大鼠肝臟卵圓細胞增殖活化模型，然后采用鏈脲佐菌素（streptozotocin ，STZ ）誘導大鼠體內高血糖環(huán)境，研究激活的肝臟卵圓細胞在自身高血糖環(huán)境下的功能，為糖尿病的干細胞治療提供相關的實驗支持。本研究分為三個部分：
　　 第一部分：大鼠肝臟卵圓細胞活化增殖模型的建立。
　　 目的：采用2-AAF 聯(lián)合CCL4 方法建立大鼠肝臟卵圓細胞活化增殖模型，并檢測肝臟卵圓細胞增殖表達情況。
　

6、　 方法：30 只F344 大鼠隨機分為兩組，正常對照組（NC ，n=15 ）：生理鹽水(20mg ﹒kg -1 ﹒d -1 )灌胃5 天，第6 天腹腔注射生理鹽水1.9ml ﹒kg -1 ，第7 天繼續(xù)生理鹽水灌胃，連續(xù)一周；肝臟卵圓細胞組（HOC ，n=15 ）：2-AAF(20mg ﹒kg -1 ﹒d -1 )灌胃5 天，第6 天腹腔注射四氯化碳1.9ml ﹒kg -1 (1:1 溶于玉米油中)，第7 天繼續(xù)2-AAF 灌胃，持

7、續(xù)一周。四氯化碳或者生理鹽水注射12 天后，取兩組大鼠肝臟組織，蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin ，HE ）染色，顯微鏡下觀察肝臟組織的病理學變化，免疫組織化學染色檢測肝臟組織OV-6 和Thy-1 蛋白的表達情況。
　　 結果：HOC 組大鼠肝臟HE 染色可見明顯的卵圓細胞增生反應,表現(xiàn)為嗜堿性卵圓形核，體積較正常肝細胞小，胞漿較少，核漿比例較大，細胞體積大小及分布不均一，多位于匯管區(qū)及小葉間膽管附近，成簇分布

8、，且逐漸向肝實質內延伸，OV-6 和Thy-1 染色呈陽性表達；正常對照組大鼠肝臟組織的結構形態(tài)正常，未見肝臟卵圓細胞的增殖。
　　 結論：2-AAF/CCL4 方法可成功制備肝臟卵圓細胞活化增殖模型，且具有較好的穩(wěn)定性。
　　 第二部分：大鼠肝臟卵圓細胞干細胞特性的研究。
　　 目的：研究大鼠肝臟卵圓細胞傳代培養(yǎng)過程中其干細胞特征的表達情況。
　　 方法：采用兩步膠原酶灌流法和流式細胞分選法分選純化卵圓

9、細胞，將分選得到的細胞置于含有細胞因子的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)和傳代擴增。⑴倒置相差顯微鏡觀察細胞傳代過程中的形態(tài)變化；⑵透射電鏡觀察傳代后細胞的超微結構；⑶免疫細胞化學檢測傳代后細胞OV-6 、c-kit和Thy-1.1 干細胞標志物的表達；⑷逆轉錄-多聚酶鏈反應（reversetranscription-polymerase chain reaction ，RT-PCR ）檢測卵圓細胞內干細胞標志（c-kit ）、肝細胞標志（HNF-4

10、α 、AFP ）和膽管細胞標志（CK-7 、CK-19 ）的基因表達情況；⑸蛋白免疫印記（Western blotting ）檢測傳代過程中細胞內OV-6 和AFP 蛋白的表達。
　　 結果：經(jīng)分選純化得到的肝臟卵圓細胞呈克隆樣生長，1-2 周可形成完整的細胞集落，細胞聚集在集落中心，周圍呈輻射狀生長，呈單層鋪石樣結構。細胞倍增時間短，平均3-4 天需傳一代，細胞傳代培養(yǎng)可達40 天以上。①在倒置相差顯微鏡下可見細胞體積較小且大

11、小不均一，呈圓形或卵圓形，細胞核大，傳代后細胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變，依然保持上皮細胞的特點；②在透射電鏡下觀察，可見細胞直徑約5-10 μ m ，胞核大，胞漿相對較少，核漿比例高，核仁常較明顯，細胞內細胞器比較少，呈現(xiàn)幼稚細胞及未分化細胞的形態(tài)特點；③免疫細胞化學染色顯示傳代后細胞OV-6 抗體、c-kit 和Thy-1 抗體染色陽性；④RT-PCR示傳代后細胞內可檢測到c-kit 、HNF-4 α 、AFP 、CK-7 和CK-19 基

12、因的表達；⑤Western blotting 可見傳代過程中，卵圓細胞中OV-6 蛋白持續(xù)表達，AFP 蛋白表達逐漸增強。
　　 結論：大鼠肝臟卵圓細胞體外可大量擴增培養(yǎng)并且保留其干細胞的一些生物學特性。
　　 第三部分：體內高糖環(huán)境下肝臟卵圓細胞的功能研究。
　　 目的：通過建立肝臟卵圓細胞活化增殖模型，研究肝臟卵圓細胞在鏈脲佐菌素誘導的體內高糖環(huán)境下的功能。
　　 方法：Wistar 大鼠21 只分為

13、肝臟卵圓細胞組（HOC ，n=7 ）、糖尿病組（DM ，n=7 ）和正常對照組（NC ，n=7 ）。HOC 組用2-AAF 聯(lián)合CCL4方法建模，成模后腹腔注射STZ （60mg/kg ）誘導體內高血糖；DM 組腹腔注射STZ （60mg/kg ）建模，正常對照組。監(jiān)測三組大鼠隨機血糖；STZ處理后7 天和15 天三組大鼠行腹腔糖耐量試驗；STZ 處理20 天后，免疫組織化學檢測三組大鼠肝臟中Insulin 的表達，RT-PCR 檢測三

14、組大鼠肝臟中胰腺內分泌激素Insulin-1 和胰腺轉錄因子Pdx-1 、Nkx6.1 的基因表達情況。
　　 結果：STZ 處理后HOC 組最初血糖水平較高，15 天后開始下降，與DM 組比較P<0.05 ；腹腔糖耐量試驗可見，HOC 組大鼠血糖調節(jié)能力明顯強于DM 組；RT-PCR 示HOC 組在STZ 處理前肝臟可較弱表達Nkx6.1 和Pdx-1mRNA ，不表達Insulin-1mRNA ；STZ 誘導的高糖下，Nkx