肝細(xì)胞癌來源于肝前體細(xì)胞—卵圓細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景 原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在所有惡性腫瘤中居第三位。目前，關(guān)于HCC的細(xì)胞源研究取得了較大進(jìn)展，已有實(shí)驗(yàn)證明肝內(nèi)卵圓細(xì)胞在致癌因素的作用下可向癌細(xì)胞異常分化，因此，有許多學(xué)者認(rèn)為肝內(nèi)卵圓細(xì)胞為HCC的源細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)證據(jù)又使人們聯(lián)想到肝癌可能來源腫瘤干細(xì)胞?？赡茉谥掳┪镔|(zhì)的的作用下卵圓細(xì)胞異常分化，導(dǎo)致肝細(xì)胞癌變。肝臟干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞的關(guān)系尚

2、沒有系統(tǒng)研究的報(bào)告。 腫瘤具有異質(zhì)性，瘤組織并非全部由染色體異常的細(xì)胞組成，其內(nèi)增殖狀態(tài)的細(xì)胞實(shí)際上是腫瘤組織的干細(xì)胞。大量的動物自體瘤移植試驗(yàn)證明，只有當(dāng)腫瘤細(xì)胞數(shù)大于1×106時(shí)才可形成腫瘤，將人的腫瘤細(xì)胞經(jīng)皮下注射給小鼠也會產(chǎn)生同樣結(jié)果。在白血病和多發(fā)性骨髓瘤中，僅有1/1000或1/100的腫瘤細(xì)胞集落能在體外克隆增殖。將白血病細(xì)胞接種小鼠，也僅有1-4％的細(xì)胞能形成脾集落。說明并不是所有的腫瘤細(xì)胞都能增殖，可能只有小部

3、分細(xì)胞具有致瘤源性。在原發(fā)腫瘤組織中存在著不同的腫瘤細(xì)胞亞群，這些亞群細(xì)胞具有不同的形態(tài)、表型和功能的特征。 本研究主要探討HCC的腫瘤干細(xì)胞源、干細(xì)胞的表面標(biāo)記及耐藥蛋白在肝癌組織中不同亞群細(xì)胞的表達(dá)，為HCC的發(fā)生、發(fā)展腫瘤干細(xì)胞學(xué)說及腫瘤耐藥機(jī)制提供理論依據(jù)。 目的 研究肝細(xì)胞癌與卵圓細(xì)胞的關(guān)系，探討HCC的腫瘤干細(xì)胞來源，初步研究人肝細(xì)胞癌干細(xì)胞表面標(biāo)志特征。原代培養(yǎng)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞，克隆分離異質(zhì)性亞群細(xì)胞

4、，檢測不同亞群的生物學(xué)特性、異體成瘤能力、表型特征、對化療藥物的敏感性及耐藥蛋白的表達(dá)，探討HCC異質(zhì)性機(jī)制，為HCC的發(fā)生、發(fā)展及臨床靶向治療提供理論依據(jù)。 方法 我們選用卵圓細(xì)胞的部分表面標(biāo)記，通過免疫組織化學(xué)法檢測它們在HCC組織中細(xì)胞的表達(dá)；原代培養(yǎng)肝癌細(xì)胞，利用卵圓細(xì)胞的表面標(biāo)記免疫分選亞群細(xì)胞，檢測不同亞群細(xì)胞的異體成瘤能力差異，篩選成瘤能力強(qiáng)的亞群，根據(jù)對應(yīng)的強(qiáng)致瘤亞群表面標(biāo)記初步確定腫瘤干細(xì)胞的可能表型；

5、有限稀釋法克隆克隆分選異質(zhì)性亞群細(xì)胞，對比生物學(xué)特性、成瘤能力、表面標(biāo)記的異同表達(dá)及多藥耐藥蛋白的異同探討肝腫瘤異質(zhì)性機(jī)制及耐藥機(jī)制。 1.免疫組織化學(xué)法檢測病人肝癌組織細(xì)胞卵圓細(xì)胞部分表面標(biāo)記的表達(dá)：選用卵圓細(xì)胞表面標(biāo)記CK7、CK18、CK19、CD34、c-kit，利用免疫組織化學(xué)法(SABC)檢測在HCC組織內(nèi)細(xì)胞的表達(dá)。 2.原代培養(yǎng)HCC細(xì)胞，選用卵圓細(xì)胞表面標(biāo)記CD34、c-kit、Thy-1、CK7、CK

6、14和CK19，通過親和板結(jié)合分離法分離肝癌細(xì)胞亞群，檢測各表面標(biāo)記亞群陰性細(xì)胞和陽性細(xì)胞間的裸鼠移植成瘤能力，確定成瘤有顯著差異的亞群組，按原濃度1/4和1/10比例稀釋，檢測在低密度下該亞群組陰陽性細(xì)胞的成瘤能力，初步確定可能的腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記。 3.原代培養(yǎng)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞，應(yīng)用有限稀釋法對培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞克隆分離異質(zhì)性亞群，并應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定亞群細(xì)胞倍增時(shí)間及倍增數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測其DNA含量確定細(xì)胞周期分布，

7、裸鼠異體移植檢測成瘤能力，分別以RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)分析檢測亞群細(xì)胞間表面標(biāo)記的差異。 4.通過MTT法分別測定人肝細(xì)胞癌異質(zhì)性亞群細(xì)胞在不同濃度、不同化療藥物(ADM、VP-16、DDP)作用下的抑制率，計(jì)算每種藥物IC50值。應(yīng)用流式細(xì)胞儀分別檢測各組每次藥物刺激后耐藥相關(guān)蛋白MDR1、MRP、LRP、GST、的陽性細(xì)胞數(shù)及平均熒光強(qiáng)度，以此推算出不同亞群細(xì)胞各耐藥蛋白平均表達(dá)量。 結(jié)果 1.在20例肝

8、癌組織中CK18表達(dá)陽性，CK19除了在小膽管上皮細(xì)胞表達(dá)外，在肝癌組織細(xì)胞中表達(dá)陰性；14例肝細(xì)胞癌CK7陽性，表達(dá)率70％(14/20)；9例表達(dá)c-kit，陽性率為45％(9/20)；在20例肝癌組織中，除毛細(xì)血管上皮表達(dá)CD34外，沒有一例腫瘤細(xì)胞表達(dá)CD34。在4例正常肝組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)未見CK7、c-kit表達(dá)。CK7、c-kit表達(dá)與患者年齡、性別無關(guān)，與腫瘤大小、是否合并肝硬化以及組織學(xué)分級也不相關(guān)(P＞0.05)。

9、 2.(1)CK7、CD34、c-kit3個(gè)表型陰性和陽性腫瘤細(xì)胞間成瘤能力差異顯著(P＜0.05)。CK7陽性細(xì)胞、CD34陰性細(xì)胞與c-kit陽性細(xì)胞成瘤重量分別為1364.895±157.049mg，973.290±167.794mg和1361.295±357.379mg，對應(yīng)細(xì)胞亞群分別為132.663±251.083mg，644.855±135.846mg和89.116±166.851mg。CK7陽性細(xì)胞、c-kit陽性細(xì)胞

10、、CD34陰性細(xì)胞與對應(yīng)亞群比較，t=10.516，P＜0.001；t=7.337，P＜0.001和t=4.723，P=0.002，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他分選標(biāo)記亞群間未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異。 (2)CK7陽性細(xì)胞與陰性細(xì)胞1/4倍稀釋后，CK7陽性細(xì)胞成瘤比例為100％(8/8)，對應(yīng)亞群細(xì)胞未成瘤(0/8)，1/10倍稀釋后CK7陽性細(xì)胞成瘤比例為62.5％(5/8)。c-kit陽性細(xì)胞與陰性細(xì)胞1/4倍稀釋后，c-kit陽性

11、細(xì)胞成瘤比例為100％(8/8)，對應(yīng)亞群細(xì)胞未成瘤(0/8)，1/10倍稀釋后c-kit陽性細(xì)胞成瘤比例為75％(6/8)。CD34陰性細(xì)胞與陽性細(xì)胞1/4倍稀釋后，CD34陰性細(xì)胞成瘤比例為75％(6/8)，對應(yīng)亞群細(xì)胞未成瘤(0/8)，1/10倍稀釋后CD34陰性細(xì)胞成瘤比例為37.5％(3/8)。 3.(1)肝細(xì)胞癌原代培養(yǎng)后克隆分離到LCSC-1及LCSC-2兩個(gè)癌細(xì)胞亞群，LCSC-1亞群細(xì)胞呈長梭形，體外增殖能力強(qiáng)

12、，裸鼠異體移植不能成瘤；LCSC-2亞群細(xì)胞呈多角形、多突起，裸鼠異體移植成瘤100％(8/8)，亞克隆的子代細(xì)胞裸鼠異體移植成瘤100％(8/8)。 (2)LCSC-1和LCSC-2亞群細(xì)胞的生長特點(diǎn)在功能上兩亞群細(xì)胞也存在明顯差異，LCSC-1細(xì)胞和LCSC-2細(xì)胞倍增時(shí)間及最高增殖倍數(shù)分別是17.87±1.99h、16.13±0.60h和29.63±3.20h、12.30±0.79h。兩亞群比較，t=5.41，P=0.00

13、6；t=6.66，P=0.003。LCSC-1具有更旺盛的增殖能力。 (3)LCSC-1和LCSC-2亞群細(xì)胞周期檢測LCSC-1細(xì)胞和LCSC-2細(xì)胞周期分布分別是：G1期51.00±2.27％，S期30.23±1.46％，G2/M期18.77±3.70％；G1期66.70±3.08％，S期19.80±1.25％，G2/M期13.50±2.00％。兩亞群比較，t=7.11，P=0.002；t=9.38，P=0.001；t=2.

14、21，P=0.092。無論是G1期比例，還是S+G2M期，兩亞群的細(xì)胞周期比例有顯著性差別。 (4)RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)分析檢測卵圓細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)：LCSC-2亞群表達(dá)CK7、CK18、c-kit；LCSC-1亞群表達(dá)CK7、CK18，不表達(dá)c-kit；兩亞群細(xì)胞不表達(dá)CD34、CK19。 4.(1)LCSC-1和LCSC-2亞群細(xì)胞對阿霉素(ADM)、順鉑(DDP)、鬼臼乙叉苷(VP-16)等藥物都產(chǎn)生了耐藥

15、性。這些化療藥對LCSC-1和LCSC-1亞群細(xì)胞的IC50值分別是：ADM0.261±0.107μg/ml，DDP2.089±0.220μg/ml，VP-1652.766±6.134μg/ml；ADM3.013±0.012μg/ml，DDP8.591±0.643μg/ml，VP-16115.534±4.924μg/ml。兩組比較，t=44.12，P=0.001；t=16.573，P=0.001；t=13.822，P=0.001。三種藥

16、物對LCSC-2亞群細(xì)胞和LCSC-1亞群細(xì)胞抑制率有顯著差異(P＜0.01)。 (2)LCSC-1和LCSC-1亞群細(xì)胞MDR1、MRP、LRP、GST的表達(dá)量分別是：23.97±0.34％、17.03±0.59％、24.02±0.63％、23.93±0.59％；26.59±0.78％、19.43±0.60％、26.43±1.06％、26.24±1.06％；兩亞群比較，t=5.32，P=0.006；t=4.94，P=0.008

17、；t=3.85，P=0.028；t=3.30，P=0.030。兩亞群細(xì)胞MDR1、MRP、LRP、GST的表達(dá)有顯著性差異。 結(jié)論 1.肝細(xì)胞癌組織中存在表達(dá)卵圓細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞，其表達(dá)CK7、c-kit，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34。提示，HCC可能不是起源于肝干細(xì)胞而是來源于過渡性的前體細(xì)胞/祖細(xì)胞，如來源于Hering管的卵圓細(xì)胞。 2.肝細(xì)胞癌組織中免疫法分選的CD34-、CK7+、c-kit+腫瘤亞群

18、細(xì)胞具備很強(qiáng)的成瘤能力，具備一定的TSC特征，表明CD34-、CK7+、c-kit+可能是人肝細(xì)胞癌TSC的部分表型標(biāo)志。 3.原發(fā)肝細(xì)胞癌存在異質(zhì)性亞群，分別在形態(tài)、增殖能力、成瘤性及表面標(biāo)志存在異質(zhì)性。腫瘤異質(zhì)性可能產(chǎn)生于腫瘤干細(xì)胞的不對稱分化。 4.MRP、LRP、GST、MDR1的高表達(dá)，可能是人肝癌細(xì)胞異質(zhì)性亞群多耐藥產(chǎn)生的部分分子基礎(chǔ)，耐藥是肝細(xì)胞癌干細(xì)胞的特征之一。表達(dá)耐藥蛋白的水平高低也許是腫瘤異質(zhì)性耐藥