骨橋蛋白促進肝干細胞-肝前體細胞增殖和遷移的研究.pdf

1、當肝臟受到嚴重損傷，尤其是在肝細胞的增殖受到抑制的時候，會產(chǎn)生一種被稱作“卵圓細胞”的肝干細胞/肝前體細胞，依賴卵圓細胞完成對肝臟的修復和肝再生過程。這些細胞之所以被稱作是肝干細胞/肝前體細胞，是由于它們既表達肝細胞的標記物（Alb和AFP）又表達膽管細胞的標記物(CK19)，并且有分化成肝細胞和膽管上皮細胞的潛能。
　　 骨橋蛋白(osteopontin，OPN)，也被稱作早期T淋巴細胞激活基因1，是一種磷酸化的糖蛋白。它廣泛

2、參與機體的多種生理和病理過程，包括保護細胞與抑制細胞凋亡;調控內(nèi)皮細胞的遷移以及炎癥細胞的趨化，如巨噬細胞的募集;改善損傷組織的重構與修復;OPN的高表達還能促進癌細胞的轉移，如乳腺癌和肝癌的惡化。OPN的高表達和各類疾病的預后有顯著的相關性。在腫瘤惡化方面， OPN已成為一個潛在的生物標記物。OPN在一些有膽管細胞增殖的肝臟疾病中表達上調，例如非酒精性脂肪肝炎、爆發(fā)性肝炎和膽道閉鎖。然而，它在肝前體細胞中的作用還不清楚。
　　

3、 為了更好的研究卵圓細胞，我們利用一個穩(wěn)定的卵圓細胞增殖模型—膽堿缺乏飼料并補充乙硫氨酸(choline-deficient，ethionine-supplemented diet，CDE)。這個模型是誘導大鼠肝臟產(chǎn)生卵圓細胞的經(jīng)典模型之一。
　　 野生型(wild type，WT)小鼠隨機分成兩組，分別喂食2周的正常飼料(controldiet)和50％ CDE飼料。通過檢測不同時間50％ CDE處理的小鼠肝臟中OPN的mRN

4、A表達水平，我們發(fā)現(xiàn)在CDE誘導卵圓細胞產(chǎn)生的過程中，肝臟中的OPN表達逐漸增加。但是在這種模型中，OPN表達增加發(fā)生在何種類型的細胞以及在這些細胞中發(fā)揮什么樣的作用尚不明確。我們通過免疫組化以及免疫熒光共染技術檢測發(fā)現(xiàn)OPN只在卵圓細胞中高表達，沒有明顯的證據(jù)表明其它類型的細胞也高表達OPN。為了研究OPN在卵圓細胞中的作用，我們在實驗中引入了OPN基因敲除小鼠(OPN gene knockout mouse，OPN-KO)。WT和O

5、PN-KO小鼠分別喂食2周的50％ CDE飼料，PanK和EpCAM免疫熒光結果顯示，OPN-KO小鼠中的卵圓細胞數(shù)量明顯少于WT小鼠。PCNA染色、BrdU增殖實驗、四甲基偶氮唑鹽改良實驗(MTS)以及克隆形成等實驗結果顯示，OPN能夠促進卵圓細胞的增殖能力和自我更新能力;此外，我們通過細胞標記保留實驗比較WT和OPN-KO中的肝干細胞庫，結果顯示，OPN可能通過影響肝干細胞庫，尤其是膽管細胞和膽管周圍的肝細胞的數(shù)量，從而影響卵圓細胞

6、的產(chǎn)生。細胞遷移實驗、免疫熒光、WesternBlotting、抗體阻斷、RNA干擾抑制OPN表達以及其他實驗結果顯示，OPN能夠促進卵圓細胞的遷移能力并賦予卵圓細胞間質樣的特性?？贵w阻斷實驗以及添加條件培養(yǎng)上清和重組蛋白的實驗顯示，分泌型OPN在卵圓細胞增殖和遷移的過程中發(fā)揮很重要的作用。最后，通過免疫組織化學和免疫熒光技術發(fā)現(xiàn)50％ CDE誘導產(chǎn)生的腫瘤為混合型的腫瘤(combined hepatocellular carcinom

7、a and cholangiocarcin-oma，cHCC-CC)并且表達干細胞的標記物——EpCAM，說明該種類型的腫瘤可能起源于肝干細胞/肝前體細胞。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，OPN可能通過促進β-Catenin信號通路的激活使得卵圓細胞增殖并促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。對77例人肝癌臨床病例的研究發(fā)現(xiàn)，OPN的高表達與β-Catenin在胞漿/胞核中的表達成正相關。
　　 本課題闡明了在50％ CDE模型中，增殖的卵圓細胞高表達OPN;

8、 OPN有利于肝干細胞庫的維持;分泌型OPN能夠促進卵圓細胞的增殖和遷移能力;OPN可能通過Src降低E-cadherin的表達，釋放游離的β-Catenin入胞漿，通過激活β-Catenin信號通路影響了卵圓細胞的增殖和后期的腫瘤發(fā)生。
　　 肝干細胞參與肝臟的多種病理過程。隨著研究的不斷深入，針對肝干細胞的特異性標記物、調控肝干細胞的細胞因子以及信號分子等關鍵因素必將得到闡明，這對研究肝臟的發(fā)育，以及針對肝干細胞的診斷和治療