小鼠胚胎干細(xì)胞向肝前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化及其對實(shí)驗(yàn)性急性肝衰竭的移植治療研究.pdf

1、目的 1.建立小鼠ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，并將GFP(Greenfluorescenceprotein，GFP)基因轉(zhuǎn)染到ES細(xì)胞，通過熒光顯微成像技術(shù)可以對ES細(xì)胞進(jìn)行示蹤作用，并觀察ES細(xì)胞的生長培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)、生物學(xué)及其超微結(jié)構(gòu)。 2.小鼠ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化為HPCs的條件建立及其優(yōu)化。 3.小鼠ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)誘導(dǎo)為HPCs的分子生物學(xué)鑒定，并初步探討ES細(xì)胞誘導(dǎo)為HPCs的分子機(jī)制。

2、 4.將體外培養(yǎng)誘導(dǎo)的18dHPCs移植并整合到移植受體小鼠肝脾組織的實(shí)驗(yàn)研究，檢測移植細(xì)胞的功能。 5.將體外培養(yǎng)誘導(dǎo)的18dHPCs用于治療小鼠急性肝衰竭模型的實(shí)驗(yàn)研究。 方法 1.小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng)：首先制備MEF(mouseembryonicfibroblast，MEF)，應(yīng)用絲裂霉素C(mitomycinC，mitoC)處理MEF細(xì)胞1h后，將ES細(xì)胞培養(yǎng)在MEF細(xì)胞上，并將GFP基因轉(zhuǎn)染到ES細(xì)胞中。

3、應(yīng)用免疫組化檢測ES細(xì)胞堿性磷酸酶(alklinephosphatase，ALP)，用透射電鏡觀察ES細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 2.比較懸滴培養(yǎng)技術(shù)與懸浮培養(yǎng)技術(shù)制備擬胚體(embryoidbodies，EBs)效果、EBs直接貼壁誘導(dǎo)與EBs分散成單細(xì)胞誘導(dǎo)、有血清誘導(dǎo)法與無血清誘導(dǎo)法，不同包被介質(zhì)對EBs貼壁率的影響以及不同誘導(dǎo)因子的選擇對肝前體細(xì)胞誘導(dǎo)的影響等。觀察EBs的生長特性、分化的HPCs特點(diǎn)，探討ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化為HPCs

4、的最佳條件。 3.按照所確定的優(yōu)化條件從ES細(xì)胞誘導(dǎo)出18dHPCs在電鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征；免疫組化染色檢測CK18、CK19，測定HPCs產(chǎn)生白蛋白能力、合成尿素與糖能力、PAS反應(yīng)以及細(xì)胞線粒體能量代謝關(guān)鍵酶COX、SDH，利用RT-PCR測定ES細(xì)胞及其向HPCs分化過程中ALB、AFP、G-6-P、GATA4、OCT4、HNF3α、HNF4α的表達(dá)情況。 4.將從ES細(xì)胞誘導(dǎo)出的18dHPCs用熒光染料H

5、ochest3342標(biāo)記；小鼠移植受體采用2-AAF(2-acetylaminofluorene，2-AAF)處理2周、經(jīng)7Gy60Co進(jìn)行亞致死劑量輻照，并在移植前進(jìn)行肝臟50％PHx；將標(biāo)記好的HPCs通過小鼠尾靜脈、肝門靜脈以及直接穿刺移植方式移植到受體小鼠肝臟、脾臟組織，移植4周后檢測移植細(xì)胞在肝脾組織的功能與生長情況。 5.利用D-半乳糖胺一次性腹腔內(nèi)注射致敏，然后將LPS(內(nèi)毒素)通過小鼠腹腔注射誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模

6、型，根據(jù)小鼠死亡率、肝臟病理及肝功能損傷程度選擇小鼠ALF的最適D-半乳糖胺/LPS誘導(dǎo)劑量。移植受體模型制備后6h，從小鼠尾靜脈直接穿刺移植6.0×106細(xì)胞(細(xì)胞懸液中細(xì)胞濃度為6×107細(xì)胞/ml)；對照組和模型組亦從小鼠尾靜脈注射PBS以作對照。在HPCs移植后1d、3d、7d，檢測對照組、模型組、治療組肝功能指標(biāo)ALT、AST、ALP、ALB和TBil，測定血漿凝血酶原時(shí)間(PT)；同時(shí)留取相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)動(dòng)物肝臟組織進(jìn)行冰凍切片作

7、病理學(xué)觀察。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.ES細(xì)胞在1Oμg/mlmitoC處理1h后的MEF細(xì)胞上生長旺盛，ES細(xì)胞克隆成梭行、圓形或橢圓形狀生長，ES細(xì)胞克隆周邊與MEF細(xì)胞邊緣清楚。轉(zhuǎn)染上了GFP基因的ES細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下能發(fā)出綠色熒光。培養(yǎng)的ES細(xì)胞克隆ALP染色陽性，并且在電鏡下ES細(xì)胞核大，核形不規(guī)則，核仁大且多，細(xì)胞器少，胞體表面微絨毛較少，具有原始幼稚細(xì)胞特點(diǎn)。 2.制備EBs細(xì)胞采用懸浮培養(yǎng)技術(shù)與懸滴培

8、養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合的效果最好。在誘導(dǎo)分化中，EBs在0.03％Ⅰ型膠原蛋白、1％Matrigel、0.3％明膠包被介質(zhì)上貼壁較好；有血清誘導(dǎo)法較無血清誘導(dǎo)法細(xì)胞生長較好；EBs分散成單細(xì)胞誘導(dǎo)的HPCsALB陽性率較高可達(dá)到56.7％。在HPCs誘導(dǎo)因子的選擇中加入EGF、Acid-FGF、HGF等細(xì)胞因子的誘導(dǎo)效果最好。 3.按照所確定的優(yōu)化條件所誘導(dǎo)分化的18dHPCs在電鏡下常見雙核細(xì)胞，細(xì)胞表面有許多類似肝細(xì)胞表面的微絨毛，細(xì)

9、胞內(nèi)細(xì)胞器豐富，可見線粒體、內(nèi)織網(wǎng)、高爾基體、糖顆粒以及脂肪顆?；蚩张轄罱Y(jié)構(gòu)，常見由兩個(gè)以上細(xì)胞圍成的腔隙樣結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)的HPCs在15d～18d分泌白蛋白較高；18dHPCs具有合成糖、尿素氮能力，但低于胎肝細(xì)胞的糖與尿素氮合成能力；18dHPCs可見CK18、CK19陽性細(xì)胞，PAS反應(yīng)陽性。18dHPCs線粒體能量代謝的關(guān)鍵酶COX、SDH的染色陽性，但其強(qiáng)度明顯低于胎肝細(xì)胞；RT-PCR實(shí)驗(yàn)也表明HPCs在誘導(dǎo)晚期能表達(dá)ALB、A

10、FP、G-6-P基因。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，18dHPCs已經(jīng)開始具有一定的肝細(xì)胞功能。在HPCs的誘導(dǎo)分化過程中，GATA4和OCT4的表達(dá)在ES細(xì)胞開始誘導(dǎo)過程中逐漸減弱，6d后基本檢測不到，而HNF3α、HNF4α則相反，HNF3α在誘導(dǎo)過程的第6d開始檢測到，HNF4α在開始誘導(dǎo)的第9d開始檢測到，這些肝細(xì)胞核因子均與HPCs誘導(dǎo)分化過程密切相關(guān)。 4.通過尾靜脈注射移植、肝脾直接注射移植以及肝門靜脈移植18dHPCs4周后

11、檢測表明，HPCs能夠遷移到肝脾組織整合生長，移植細(xì)胞能產(chǎn)生白蛋白，小鼠肝脾均未見腫瘤組織或者畸胎瘤生成。另外，通過肝門靜脈移植后，有少許HPCs還遷移到脾臟組織整合生長。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們所誘導(dǎo)的18dHPCs可用作肝細(xì)胞移植材料。 5.根據(jù)小鼠存活率、肝臟病理變化及肝功能的損害指標(biāo)，我們選擇每只小鼠注射800mgD-半乳糖胺/20μgLPS/Kg體重劑量。在小鼠ALF模型組，D-半乳糖胺/LPS誘導(dǎo)后第1d，ALT、AST、

12、ALP、TBil、PT指標(biāo)開始顯著升高，第3d肝功能受損處于高峰，第7d明顯回落。模型組與治療組相比較，在第1d除PT有顯著改變外(P＜0.05)，其余指標(biāo)無顯著改變；在第3d除ALB外，其它指標(biāo)均有顯著改變(P＜0.01)；在第7d除AST、ALB外，ALT、ALP(p＜0.05)，T.Bil、PT(P＜0.01)均有顯著改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HPC移植能改善ALF的肝功能。 結(jié)論 1.建立了體外小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，并將

13、GFP基因成功轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞作為示蹤作用；對ES細(xì)胞的生長特性、生物學(xué)特性及其超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察。ES細(xì)胞在MEF細(xì)胞和含1000U/mlLIF的培養(yǎng)介質(zhì)中容易培養(yǎng)成功，細(xì)胞增殖旺盛，并且能夠保持ES細(xì)胞特性，可以作為種子細(xì)胞來源，為ES細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和組織工程重建等后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。 2.建立起了將ES細(xì)胞誘導(dǎo)為肝前體細(xì)胞的優(yōu)化條件。在誘導(dǎo)分化中，采用懸浮培養(yǎng)技術(shù)與懸滴培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合制備EBs，以0.03％Ⅰ型膠原蛋白為包被介質(zhì)

14、，以誘導(dǎo)早期acid-FGF，中期含HGF、EGF，晚期含ITS、地塞米松、OSM，并且均含F(xiàn)BS、硫代甘油為培養(yǎng)介質(zhì)，以EBs分散成單細(xì)胞來進(jìn)行分步誘導(dǎo)18d，所收獲HPCs生長旺盛，形態(tài)典型，并且在所誘導(dǎo)的18dHPCs中有56.7±6.8％的細(xì)胞為ALB陽性。 3.HPCs的分化受到細(xì)胞基質(zhì)成份、細(xì)胞因子、細(xì)胞密度、包被介質(zhì)、誘導(dǎo)方法等影響因素有關(guān)。所使用的優(yōu)化誘導(dǎo)方法，在第12dRT-PCR即可檢測到ALB表達(dá)，在第9d

15、RT-PCR可以檢測出AFP表達(dá)，特別是在第18d的HPCs，ALB與AFP均成較強(qiáng)陽性表達(dá)，HPCs能夠合成糖，尿素氮，可見CK18、CK19陽性細(xì)胞，線粒體標(biāo)志酶COX、SDH均出現(xiàn)陽性表達(dá)，表明所誘導(dǎo)的HPCs具有肝細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)和肝細(xì)胞的功能性特征。同時(shí)檢測了部分內(nèi)胚層轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，GATA4和OCT4的表達(dá)在ES細(xì)胞開始誘導(dǎo)過程中逐漸減弱，6d后基本檢測不到，而HNF3α、HNF4α則相反，表明肝細(xì)胞核因子GATA4、OCT4與H

16、NF3α、HNF4α與HPCs誘導(dǎo)分化過程密切相關(guān)，并進(jìn)一步探討了ES細(xì)胞分化為肝前體細(xì)胞的部分分子機(jī)理。 4.通過細(xì)胞移植將我們所誘導(dǎo)的18dHPCs移植到處理過的小鼠移植受體，HPCs能夠遷移到肝脾組織整合生長，能表達(dá)ALB，無腫瘤或畸胎瘤組織生成，表明我們所誘導(dǎo)的18dHPCs可用作肝細(xì)胞移植材料；同時(shí)對小鼠移植受體進(jìn)行喂飼2-AAF、50％PHx肝臟、7Gy60Co亞致死劑量輻照的移植受體模型是可行的，能夠取得較好的移植