胚胎干細胞向胰島素分泌細胞分化的誘導及糖尿病細胞移植治療的實驗研究.pdf

1、胚胎干細胞(ES)是一種來源于胚胎內(nèi)細胞團的全能型干細胞，具有分化為各種組織細胞的潛能，在適宜的條件下可分化為人們需要的細胞用于某些疾病的治療。 糖尿病是由于胰島β-細胞破壞或胰島素抵抗所致的胰島素絕對或相對缺乏。補充胰島素是Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病的傳統(tǒng)治療手段。胰島素治療雖能控制癥狀、延緩和減少并發(fā)癥的發(fā)生，但不能使糖尿病徹底治愈。利用ES細胞的全能分化特性，將ES細胞定向地誘導為胰島素分泌細胞(IPC)用于糖尿病的治療，有可能

2、使糖尿病得到治愈。 多項研究表明，ES細胞可誘導分化為具有胰島素分泌功能的IPC，這些細胞移植給糖尿病小鼠后有一定的治療作用，這為糖尿病的細胞移植治療帶來了希望。但由ES細胞誘導生成的IPC數(shù)量少、功能較差、誘導時間長、誘導過程復(fù)雜，與臨床運用的要求尚有一定差距。 胰腺十二指腸同源盒-1基因(pdx-1)是調(diào)節(jié)胰腺發(fā)育和胰島β細胞分化的關(guān)鍵基因，也是維持正常胰島β細胞生理功能不可缺少的基因。用pdx-1基因轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干

3、細胞，使之高表達pdx-1，有可能增加ES細胞向胰島素分泌細胞分化的轉(zhuǎn)化率，提高其胰島素的分泌功能。 為了縮短IPC的誘導周期，簡化誘導方法，提高IPC的獲得量和胰島素分泌功能，我們構(gòu)建了攜帶綠色熒光蛋白報告基因的pdx-1基因真核表達載體，將pdx-1轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細胞后在轉(zhuǎn)染細胞中獲得了表達；經(jīng)過對ES細胞培養(yǎng)擴增和ES細胞向IPC分化誘導的系統(tǒng)實驗觀察，我們改進了胰島素分泌細胞的誘導方法，縮短了誘導時間；將胰島素分泌細胞移

4、植于糖尿病小鼠后，這些細胞能在小鼠體內(nèi)存活增殖，并使血糖恢復(fù)正常。主要實驗結(jié)果如下： 1、從孕小鼠分離胚胎成纖維細胞(MEF)，純化后用于ES細胞飼養(yǎng)層的制備。發(fā)現(xiàn)胎齡13.5d的胚胎用于分離MEF效果最好，大于15d或小于11d的胚胎均不能得到數(shù)量足夠、增殖能力旺盛的MEF；在進行絲裂霉素C(MMC)處理時，第2-4代MEF用10μg/ml濃度的MMC在37℃處理60min-90min為宜。 采用MEF飼養(yǎng)層和白血病抑

5、制因子(LIF)相結(jié)合的方法培養(yǎng)ES細胞，可有效地防止ES細胞的分化。在MEF飼養(yǎng)層上，ES接種4d之內(nèi)可以保持旺盛的增殖而不發(fā)生分化；連續(xù)培養(yǎng)4d之后，ES細胞出現(xiàn)不同程度分化，并逐步消失；進行無飼養(yǎng)層培養(yǎng)時，ES增殖緩慢并容易出現(xiàn)早期分化，難于在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件下長期維持。 2、從小鼠胰腺組織提取總RNA后，用RT-PCR法擴增了876bp長度的小鼠pdx-1基因cDNA，經(jīng)過電泳、回收、純化后與攜帶綠色熒光蛋白報告基因的質(zhì)

6、粒載體pEGFP-N1重組成新的載體pEGFP/pdx-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后在細菌中擴增質(zhì)粒。經(jīng)過質(zhì)粒抽提，酶切，電泳分析和DNA測序鑒定，876bp的pdx-1基因片段成功插入到載體中，插入方向正確。和GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列比對后確認無誤，說明載體構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)化菌擴增后抽提質(zhì)粒，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染ES細胞，24h后可見轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)有綠色熒光蛋白報告基因表達，但較弱；轉(zhuǎn)染48h后，報告基因表達增強。經(jīng)RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染

7、細胞有pdx-1表達。轉(zhuǎn)染的ES細胞轉(zhuǎn)種于新的飼養(yǎng)層上進行G418抗性篩選，在含G418300μg/ml的ES培養(yǎng)基中，有少量ES集落存活并能夠傳代。轉(zhuǎn)染4d后，報告基因不再繼續(xù)表達，pdx-1的表達也消失。但ES細胞依然可以在含G418300μg/ml的ES培養(yǎng)基存活。 3、ES細胞在飼養(yǎng)層上擴增4d后消化為單細胞，在不含LIF的EB培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)4d，形成胚胎體(EB)，收集EB進行貼壁培養(yǎng)。待EB貼壁后用無血清的神經(jīng)前體

8、細胞(NPC)選擇性培養(yǎng)基進行NPC誘導。72h內(nèi)，大量細胞死亡、脫落，剩余細胞分化為上皮樣細胞或神經(jīng)元樣細胞。誘導第4d，大部分細胞呈神經(jīng)細胞樣形態(tài)，經(jīng)nestin免疫組化染色鑒定，剩余的細胞大部分為nestin陽性細胞。誘導5d后，細胞數(shù)量減少，剩余細胞呈典型的神經(jīng)元樣形態(tài)。 經(jīng)NPC培養(yǎng)基誘導4d的細胞更換為無血清的胰島素分泌細胞(IPC)選擇性培養(yǎng)基，進行IPC誘導。培養(yǎng)3d后，神經(jīng)元樣細胞減少，但從多突起的神經(jīng)元樣細胞

9、的周邊長出許多細小的圓形細胞。增加誘導培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度后，圓形細胞逐步增多，體積增大，并聚集成團。誘導第5d出現(xiàn)雙硫腙(DTZ)染色陽性細胞。誘導第6d，DTZ陽性細胞增多。作胰島素免疫組化染色檢查，聚集成團的細胞呈胰島素染色陽性。由于IPC中的胰島素和Zn2+結(jié)合形成結(jié)晶，貯存于β顆粒中。DTZ能和Zn2+結(jié)合，使含Zn2+的細胞顯棕紅色。因此，DTZ染色被認為是胰島β細胞的特異性染色方法。在IPC培養(yǎng)基中誘導6d的細胞團具有胰島

10、β細胞的染體特征，經(jīng)胰島素免疫組化染色進一步證明這些細胞具有胰島素合成功能。 與文獻報道的28d-32d的IPC誘導時間相比，我們的誘導方案共用18d，誘導時間顯著縮短。在此基礎(chǔ)上，我們進一步改進了誘導方法，不經(jīng)過NPC階段的誘導，將擴增后的ES細胞直接進行IPC誘導。結(jié)果共經(jīng)歷14d誘導培養(yǎng)，也得到了與多階段誘導結(jié)果類似的IPC，誘導時間進一步縮短。改良誘導法不僅縮短了時間，簡化了誘導方法，也證明NPC階段不是ES細胞向IPC

11、分化的必經(jīng)階段。 4、為了進行胰島素分泌細胞的移植治療，我們采用鏈脲霉素(STZ)腹腔注射制備了糖尿病小鼠模型。實驗發(fā)現(xiàn)，STZ用80mg/Kg分2次，間隔3d給藥，比100mg/Kg一次給藥制備的糖尿病模型更適合用于細胞移植治療研究。經(jīng)多次測定空腹血糖和體重，確認模型制備成功。選擇血糖穩(wěn)定于13mmol/L-25mmol/L的糖尿病小鼠為IPC移植治療的觀察對象。將IPC消化后用hochest33342標記后給糖尿病小鼠進行移

12、植。每只小鼠移植1×106IPC于肝臟或皮下，用環(huán)孢素A預(yù)防移植排斥。結(jié)果肝臟內(nèi)移植者移植一周后血糖下降，但未恢復(fù)正常。移植后12d取肝臟進行病理切片檢查，未發(fā)現(xiàn)有標記的移植細胞。皮下移植者移植一周后血糖完全恢復(fù)正常。12d后取移植部位組織檢查，發(fā)現(xiàn)有大量移植細胞存在。移植細胞大多數(shù)成團塊狀生長，和周圍脂肪組織有明顯界。也有的移植細胞散在分布于脂肪組織中。經(jīng)胰島素免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，移植細胞呈胰島素染色陽性。說明移植的IPC在受者體內(nèi)存活

13、增殖并分泌胰島素，使糖尿病小鼠的血糖恢復(fù)正常。 雖然我們改進了IPC的誘導條件，縮短了IPC的誘導時間，將IPC用于糖尿病小鼠的實驗治療取得初步療效；構(gòu)建了pdx-1基因的表達載體，并在ES細胞內(nèi)獲得了短暫表達，為糖尿病的細胞移植治療打下了一定的基礎(chǔ)，但未能獲得構(gòu)成性表達pdx-1的ES細胞系，因而未能觀察到外源性pdx-1過表達對ES細胞向IPC分化的影響，也未能進行IPC移植治療的大批量、長時間觀察，今后應(yīng)繼續(xù)這方面的工作，