間充質(zhì)干細(xì)胞及胰島素分泌細(xì)胞治療糖尿病的臨床及應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、本研究分三部分進(jìn)行闡述:第一部分為UMSC輸注對(duì)2型糖尿病及其并發(fā)癥的臨床治療作用和相關(guān)機(jī)制研究;第二部分探討laminin411對(duì)UMSC向IPC誘導(dǎo)分化作用及其機(jī)制探討;第三部分為下一步工作計(jì)劃。具體如下:第一部分臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療2型糖尿病臨床研究
　　目的:
　　研究UMSC治療2型糖尿病及其并發(fā)癥的安全性、臨床療效及其相關(guān)機(jī)制，以期尋找一種安全、長(zhǎng)效的治療2型糖尿病及其并發(fā)癥的方法。
　　材料與方法:

2、>　　在獲得山東大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意后，無菌留取健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的臍帶組織，按照UMSC制備標(biāo)準(zhǔn)操作流程分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫表型和多向分化潛能對(duì)所獲細(xì)胞進(jìn)行鑒定。按照入組和剔除標(biāo)準(zhǔn)選取2009.07-2012.10我院收治的18例T2DM患者靜脈輸注UMSC，每次間隔2周，共2-3次，按照療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，比較治療前、治療后第1、3、6月患者的各項(xiàng)指標(biāo)變化，并詳細(xì)記錄所有不良反應(yīng)。綜合數(shù)據(jù)使用SPS

3、SI9.0軟件分析。
　　結(jié)果:
　　成功獲得符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的UMSC，該細(xì)胞具有以下特點(diǎn):呈長(zhǎng)梭形纖維樣細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)，可以穩(wěn)定傳代;高表達(dá)CD73、CD90、CDI05、CD166，低或不表達(dá)HLA-DR、CD34、CD45;具有多向分化的潛能，可以在適宜的條件下，分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。根據(jù)療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，UMSC治療分為有效組和無效組，兩者在臨床基線特征方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);治療有效組患者FBG

4、、PBG均顯著降低(p＜0.05)，血漿C肽水平和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在有效組有升高趨勢(shì)，但這兩個(gè)參數(shù)的差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。在治療過程中，18例患者中只有4例(22.2％)有輕微的發(fā)熱反應(yīng)，無其他不良反應(yīng)。UMSC治療后隨訪6個(gè)月，所有患者自覺身體一般情況較前改善，幸福指數(shù)較前提高。
　　結(jié)論:
　　UMSC治療2型糖尿病安全可靠，未見嚴(yán)重不良反應(yīng)。對(duì)部分患者，MSC能有效降低空腹和餐后血糖，其作用機(jī)制

5、可能與調(diào)節(jié)Treg生成，抑制異常免疫系統(tǒng)對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷及改善外周組織對(duì)胰島素的敏感性有關(guān)。該研究為進(jìn)一步應(yīng)用UMSC有效治療2型糖尿病奠定了實(shí)踐基礎(chǔ)。
　　第二部分臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的分化和調(diào)控
　　目的:
　　觀察laminin411對(duì)UMSC向IPC分化效率以及IPC胰島素分泌功能的影響，并探討其作用機(jī)制，為UMSC來源的1PC有效治療糖尿病奠定基礎(chǔ)。
　　材料與方法:
　　UMSC分

6、離、培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定同第一部分。經(jīng)過4個(gè)階段將UMSC誘導(dǎo)分化為IPC，通過流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR、Western blot、免疫熒光、DTZ染色及ELISA等檢測(cè)方法在細(xì)胞表面分子表達(dá)、mRNA、蛋白水平、是否為胰島β細(xì)胞及胰島素分泌等方面對(duì)所誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。在誘導(dǎo)過程中加入laminin411，首先通過上述實(shí)驗(yàn)方法體外觀察laminin411對(duì)UMSC來源的IPC分化和成熟的影響，并研究其作用機(jī)制;其次，腹腔注射60mg/kg

7、鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)破壞胰島β細(xì)胞建立Wistar大鼠1型糖尿病動(dòng)物模型，鼠尾靜脈分別輸注UMSC、UMSC誘導(dǎo)的IPC(UMSC-IPC)和添加laminin411誘導(dǎo)分化的IPC(laminin411-IPC)，通過臨床表現(xiàn)、血糖、C肽、體重、生存分析等指標(biāo)，觀察UMSC、UMSC-IPC和laminin411-IPC對(duì)糖尿病大鼠的治療作用。
　　結(jié)果:
　　在成功獲得符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的UMS

8、C的前提下，在胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白(ITS)、尼克酰胺等因子的作用下，經(jīng)過4個(gè)階段歷時(shí)2周，成功將UMSC誘導(dǎo)分化為IPC，該細(xì)胞具有胰島β細(xì)胞形態(tài)，高表達(dá)胰島β細(xì)胞的標(biāo)志物(Pdx1、Insulin)，在高糖刺激下胰島素分泌量達(dá)到（189.8±3.05）μIU/ml。在誘導(dǎo)分化過程中，加入laminin411，IPC的生成量雖無明顯增加，但胰島素分泌量增加3倍以上，達(dá)到（612.1±40.78）μIU/ml;在mRNA和蛋白水平上，lami

9、nin411可以顯著提高IPC Pdx1、Ngn3和insulin mRNA和蛋白的表達(dá);laminin411-IPC組決定性內(nèi)皮標(biāo)志物基因Sox17、Foxa2 mRNA表達(dá)較UMSC-IPC組明顯升高(p＜0.05);相關(guān)性分析表明，Pdx1和Foxa2 mRNA的表達(dá)量與胰島素的分泌量成正相關(guān)(p＜0.05)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面，通過腹腔注射STZ成功構(gòu)建了1型糖尿病大鼠模型，laminin411-IPC組IPC輸注3天后糖尿病大鼠空腹

10、血糖較UMSC-IPC組明顯降低(p＜0.05);與UMSC-1PC組比較，laminin411-1PC組能明顯降低HbA1c的水平(p＜0.05)，而和UMSC組比較，laminin411-IPC組則能顯著降低HbA1c的水平(p＜0.01); Laminin411-1PC組和UMSC-1PC組均能明顯提高糖尿病大鼠生存率和增加體重，但兩組無明顯差異。安全性方面，沒有發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　UMSC在適當(dāng)條件下

11、能夠誘導(dǎo)生成IPC; Laminin411能提高UMSC-IPC的分化程度及增強(qiáng)其分泌胰島素的功能，其機(jī)制是通過DE途徑來發(fā)揮作用的;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，laminin411-IPC能夠有效降低糖尿病大鼠的血糖，改善其臨床癥狀、延長(zhǎng)生存期;最重要的是，IPC靜脈輸注是方便、安全可靠的，為將來替代胰腺β細(xì)胞大規(guī)模臨床應(yīng)用治療糖尿病奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分:下一步的工作
　　1.臨床研究:
　　前期工作中，我們按照入組標(biāo)

12、準(zhǔn)選擇18例2型糖尿病病人，靜脈輸注UMSC，6個(gè)月隨訪結(jié)果表明UMSC治療是安全和有效的;對(duì)部分患者能夠有效降低血糖、減少降糖藥或胰島素的用量，提高生活質(zhì)量;為進(jìn)一步評(píng)價(jià)遠(yuǎn)期療效和安全性，我們將對(duì)當(dāng)前病例繼續(xù)隨訪觀察。目前臨床病例較少，可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，下一步我們將積極申報(bào)國(guó)家干細(xì)胞臨床研究基地，大規(guī)模臨床試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證治療效果，并探尋UMSC有效治療糖尿病及其并發(fā)癥的機(jī)制，為UMSC有效治療糖尿病提供理論依據(jù)。
　　2.

13、基礎(chǔ)研究:
　　(1)尋找新型的藥物，提高UMSC向IPC的轉(zhuǎn)化效率及增強(qiáng)其胰島素分泌功能，為體外高效誘導(dǎo)IPC提供新方法，以滿足將來大規(guī)模臨床應(yīng)用;
　　(2)如何降低IPC的免疫原性，避免植入的IPC遭受免疫系統(tǒng)的排斥，是下一步研究的重點(diǎn)，欲通過以下方式解決:
　　1)采用UMSC來源的IPC:由于MSC具有低免疫原性，推測(cè)其來源的IPC也具有低免疫原性，從而降低機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)其的損傷;
　　2)將UMSC和

14、IPC聯(lián)合移植，觀察能否進(jìn)一步降低機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)IPC的攻擊。
　　3)獲得自體的MSC，應(yīng)用上述方法使其向IPC分化并提高其分化效率和分泌胰島素的功能，徹底解決免疫排斥問題。
　　(3)與胰島移植所面臨的問題一致，IPC移植同樣需要選擇比較理想的移植模式，即細(xì)胞的移植部位和方式是決定IPC移植是否成功的重要環(huán)節(jié)，下一步欲比較不同的IPC移植模式（如靜脈、皮下和肌注）對(duì)IPC存活及血糖的影響，選擇最優(yōu)的移植模式，有效治療糖尿