間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化的調(diào)控及應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、研究目的:
　　糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。導(dǎo)致高血糖的機制，一般認(rèn)為來自兩個方面，胰島素分泌不足和胰島素抵抗。糖尿病的自身癥狀和多種并發(fā)癥，長期困擾著患者的身心健康。截止2014年，全國有1.14億糖尿病病人，中國已經(jīng)成為全世界第一糖尿病大國。糖尿病需要持續(xù)的醫(yī)學(xué)治療，目前常用的胰島素增敏劑和外源性的胰島素治療，只能暫時性的緩解高血糖狀況，增加靶器官對胰島素的敏感性，但是都不能徹底治愈糖尿病。目前唯一有希望能治愈糖尿

2、病的措施是胰島移植，然而胰島移植目前除了供體的來源的限制之外，還存在胰島體外存活率有限，移植后發(fā)生宿主的免疫排斥等問題，因此胰島移植尚不能理想的徹底治愈糖尿病。
　　細(xì)胞治療，特別是與胰島移植類似的胰島替代細(xì)胞的細(xì)胞治療是近年來的研究熱點，也是有希望治愈糖尿病的一種方式。近年的研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞（Embryonicstemcell，ESC）可以在體外經(jīng)過多重細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，或者基因修飾后，體外分化成為分泌胰島素的細(xì)胞(Insul

3、inproducingcell，IPC)，能在體外分泌胰島素并且注射到糖尿病動物模型中可以起到一定的治療作用。鑒于ESC在臨床治療中，存在倫理爭議，并且有可能導(dǎo)致畸胎瘤等的發(fā)生，因此ESC相關(guān)的細(xì)胞治療在大規(guī)模的臨床應(yīng)用上尚缺乏前途，亟待挖掘新的細(xì)胞來源。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcell，MSC)，是近年來研究的熱點，其多向分化和自我更新的特性，符合干細(xì)胞的一般特性，另外，MSC特有的免疫抑制作用，也有望

4、用于抑制糖尿病的自身免疫。因此，MSC作為多能干細(xì)胞，很有希望作為細(xì)胞治療糖尿病的主體。近年來，也有來自骨髓(bonemarrowderivedMSC，BM-MSC)，脂肪組織(AdiposederivedMSC，AD-MSC)等多種MSC向IPC分化的研究，但是研究發(fā)現(xiàn)，骨髓和脂肪組織來源的MSC存在年齡的差異和傳代的老化等現(xiàn)象，脂肪組織來源的MSC的成骨分化能力較弱并且體外可以促進(jìn)腫瘤的生長，而臍帶組織來源的MSC就不在年齡的差異，

5、另外臍帶組織屬于正常分娩的廢棄物，也不存在倫理的問題，因此臍帶組織來源的MSC應(yīng)該是細(xì)胞治療的良好來源。
　　此外，在目前的技術(shù)手段下，IPC的產(chǎn)生效率較低，分化程度也低，體外分泌的胰島素數(shù)量也不能滿足將來大規(guī)模臨床應(yīng)用的需要。另外，現(xiàn)有的通過基因修飾的方法進(jìn)行IPC誘導(dǎo)分化的方法，由于存在病毒載體，在臨床應(yīng)用過程中也有潛在的危險。因此，新的IPC誘導(dǎo)體系，或者舊的體系的改良以適應(yīng)大規(guī)模的臨床應(yīng)用，都迫在眉睫。
　　我們體外

6、觀察人臍帶組織來源的原代間充質(zhì)干細(xì)胞(UmbilicaltissueMesenchymalstemcell，UT-MSCorWJ-MSC)在適宜條件下誘導(dǎo)分化為胰島素分泌樣細(xì)胞(Insulinproducingcell，IPC)，研究細(xì)胞基底膜成分laminin調(diào)控IPC分化和成熟的作用及相關(guān)機制，對現(xiàn)有的方法和技術(shù)加以改良，力求得到體外胰島素分泌量明顯升高的IPC。并且在動物實驗中，觀察IPC的治療作用。
　　材料和方法:

7、>　　UC-MSC的培養(yǎng)和鑒定在獲得山東大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)后，在取得捐獻(xiàn)者簽署知情同意書的前提下，我們收集健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的臍帶組織，經(jīng)過膠原酶和胰酶的消化處理，原代培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，并且在體外大量擴(kuò)增。經(jīng)過形態(tài)學(xué)，流式細(xì)胞學(xué)免疫表型鑒定和多向分化潛能的鑒定之后，確認(rèn)成功培育出可應(yīng)用與臨床治療的符合GMP規(guī)范的臍帶組織來源的MSC。
　　IPC的誘導(dǎo)分化和改進(jìn)
　　參考現(xiàn)有的ESC和少量MSC分化的文獻(xiàn)，在

8、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白(ITS)、尼克酰胺等因子存在的適宜條件下，經(jīng)過4個階段的誘導(dǎo)分化，得到形態(tài)學(xué)相似的IPC細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)用DTZ染色、RT-PCR、免疫熒光、Westernblot等手段，確認(rèn)IPC的成功分化，然后探求添加laminin進(jìn)行進(jìn)一步的分化改進(jìn)，在體外實驗部分繼續(xù)應(yīng)用RT-PCR，WesternBlot，免疫熒光化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)等對IPC進(jìn)行mRNA，蛋白水平的分析和鑒定。并利用多種檢測手段，尋找laminin在IPC分化過程中的

9、作用機制。
　　動物實驗
　　在體內(nèi)實驗部分，在獲取了山東大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)后，以STZ造模直接破壞大鼠β細(xì)胞的方法，制作1型糖尿病Wistar大鼠動物模型。在成功建立1型糖尿病動物模型后，分組輸注細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療（生理鹽水對照組、MSC輸注治療組、IPC輸注治療組和添加laminin分化的IPC治療組等），觀察經(jīng)過不同處理的IPC對糖尿病大鼠的治療作用，包括臨床癥狀、動物的血糖水平、體重水平、生存分析等。

10、　　臨床試驗
　　我們同時進(jìn)行了MSC直接治療2型糖尿病的臨床試驗。從2009年7月到2012年10月，我們選取了在山東大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝性疾病科治療的2型糖尿病患者18例患者進(jìn)行了MSC輸注治療。輸注的平均劑量是1.8×106MSC/kg。輸注的方法是靜脈輸注。隨訪的時間是6個月。
　　結(jié)果:
　　UC-MSC是貼壁生長的長梭形纖維樣細(xì)胞，可以穩(wěn)定傳代，符合國際細(xì)胞治療協(xié)會2006年的定義標(biāo)準(zhǔn)。UC-MSC在免

11、疫表型上，高表達(dá)CD73，CD90，CD105，CD166，低表達(dá)HLA-DR，CD34，CD45。UC-MSC具有多向分化的潛能，可以在體外適宜的刺激條件下，分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。
　　UC-MSC也可以在適宜的條件下，被誘導(dǎo)分化為IPC，經(jīng)過多重手段得到驗證，是具有胰島素分泌功能的IPC，體外胰島素分泌量可以達(dá)到189.8±93.05μIU/ml，并且在mRNA和蛋白水平上，高表達(dá)胰島β細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)識（例如Pdx

12、1，Insulin等）。在添加適宜濃度的人重組層黏連蛋白(laminin)后，可以顯著的促進(jìn)IPC的產(chǎn)生和成熟，與不添加組相比較，在mRNA和蛋白水平，添加laminin可以顯著提高IPC細(xì)胞的基因Pdx1，Ngn3，Pax4和insulin等。在體外胰島素釋放試驗中，在高糖刺激的環(huán)境下，可以分泌大量的胰島素，其中l(wèi)aminin411添加后，體外胰島素分泌可以達(dá)到612.1±40.78μIU/ml，laminin511添加后，體外胰島素

13、分泌量可以達(dá)到:561.6±31.81μIU/ml，均3倍以上高于不添加laminin組。
　　在動物試驗中，添加laminin組與純MSC輸注組相比較，在生存時間，血糖水平、糖化血紅蛋白水平和體重水平等都有明顯改善。其中添加laminin411的IPC輸注組，可以更快的顯著降低血糖的水平。添加laminin511的IPC輸注治療組，有效控制血糖的時間更長。添加laminin的IPC治療組，總體顯著改善糖化血紅蛋白水平，有效緩解臨

14、床癥狀。此外，所有細(xì)胞治療組，都是安全的。
　　在臨床試驗中，經(jīng)過長達(dá)6個月的隨訪，未發(fā)現(xiàn)明顯的副反應(yīng)，總體治療有效率高達(dá)44.4％。我們的臨床試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過MSC輸注治療，空腹血糖和餐后血糖水平可以有效緩解。
　　結(jié)論:
　　UC-MSC可以在適宜的條件下分化成為成熟的具有分泌胰島素功能的細(xì)胞，在laminin存在的情況下，IPC的成熟度顯著提升，體外可以分泌多達(dá)3倍以上的胰島素，基本滿足未來治療的需要。MSC輸