人胰腺干細胞的體外擴增及其向胰島素分泌細胞分化誘導(dǎo)的實驗研究.pdf

1、[目的]優(yōu)化從人胚胎胰腺組織分離純化胰腺干細胞的方法，以最大限度地獲取胰腺干細胞，并將胰腺干細胞在體外大量擴增后誘導(dǎo)分化為胰島樣細胞團，檢測其胰島素分泌功能，尋找能用于糖尿病的干細胞移植治療的資源，為糖尿病細胞移植治療的臨床運用奠定基礎(chǔ)。
　　 [方法]無菌條件下取孕3-6月齡人工流產(chǎn)胚胎胰腺組織，剪碎后用不同濃度Ⅳ型膠原酶在相同條件下消化分離得到胰島樣細胞團(islet-like cellclusters，ICCs)，用差速貼

2、壁法分別培養(yǎng)ICCs和其他細胞，根據(jù)不同細胞的貼壁時間不同將不同細胞分離，進一步培養(yǎng)后純化，得到相對純凈的細胞成分，比較不同條件下的實驗效果。并比較不同種類培養(yǎng)基和不同濃度血清對細胞貼壁效果的影響。
　　 采用正交設(shè)計系統(tǒng)比較不同培養(yǎng)基、不同濃度血清和各種細胞因子組合(堿性成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、肝細胞生長因子)對胰腺干細胞增殖的影響，優(yōu)化胰腺干細胞的擴增體系，篩選出本實驗條件下的最佳培養(yǎng)體系，并以此系統(tǒng)對胰腺干細

3、胞進行擴增，分析擴增后的細胞總數(shù)和胰腺干細胞標志分子ABCG2和nestin陽性細胞的擴增能力。
　　 將經(jīng)過擴增的胰腺干細胞用胰島素分泌細胞(insulin-producingcells，IPCs)誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行分化誘導(dǎo)，使胰腺干細胞向IPCs分化。當有胰島樣細胞團(ICCs)形成后，DTZ染色和胰島素免疫組化鑒定。然后用葡萄糖刺激的胰島素分泌實驗(glucose-stimulated insulin secretion，GS

4、IS)收集上清液，ELISA法檢測IPCs的胰島素分泌水平。
　　 [結(jié)果]從孕3-6月胚胎胰腺組織分離胰腺干細胞，在相同分離條件下，以Ⅳ型膠原酶濃度為0.25mg/ml分離效果最好，0.5mg/ml和1mg/ml濃度效果不佳；在不同種類培養(yǎng)液和不同濃度的血清中，L-DMEM與15％小牛血清組合效果最佳，H-DMEM和RPMI1640與其他濃度血清的組合效果不好；ICCs在L-DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)36小時貼壁，其它細胞貼壁較早，

5、據(jù)此特性可以將ICCs與其他細胞分開并進一步得到純化的胰島干細胞(胰腺干細胞的主要成分)。
　　 不同濃度血清、EGF、bFGF、HGF對人胚胎胰腺干細胞的增殖有不同影響，正交實驗結(jié)果表明15％的血清，15 ng/ml EGF，5ng/ml HGF，15ng/ml bFGF最有利于胰腺干細胞的增殖。在最佳培養(yǎng)條件下，胰腺干細胞擴增良好：連續(xù)擴增15代后，細胞總數(shù)可達原來的1010倍；具有胰腺干細胞標志的ABCG2陽性細胞和nes

6、tin陽性細胞可達原來的1012倍，且ABCG2陽性細胞的擴增能力要優(yōu)于nestin陽性細胞；免疫組化染色和流式細胞儀分析，結(jié)果顯示人胚胎胰腺干細胞nestin和ABCG2抗原表達陽性，分別為(38.22±0.37)％和(53.33±7.02)％，且存在(37.3±0.79)％的nestin和ABCG2抗原共表達。
　　 胰腺干細胞在誘導(dǎo)液1：無糖DMEM+15％NBS+10mmol/L，NIC+10ng/mlHGF+不同濃度的

7、葡萄糖(0 mmol/L、2.8 mmol/L、5.6 mmol/L和11.2 mmol/L)和誘導(dǎo)培養(yǎng)液2：L-DMEM+15％血清+10mmol/L NIC+不同濃度的HGF(0ng/ml、5ng/ml和10ng/ml)中連續(xù)誘導(dǎo)15天后，出現(xiàn)ICCs，且ICCs DTZ染色陽性，胰島素免疫組化染色陽性。葡萄糖刺激的胰島素分泌實驗(GSIS)發(fā)現(xiàn)，當誘導(dǎo)液中葡萄糖濃度為2.8mmol/l時，胰島素分泌量最高為(48.97±1.80)

8、μIU；當葡萄糖的濃度一定時，誘導(dǎo)液中HGF濃度為10ng/ml時胰島素分泌量最高為(47.42±1.20)μIU。
　　 [結(jié)論]
　　 1.本實驗優(yōu)化了人胚胎胰腺干細胞的分離純化方法。在相同分離條件下，以Ⅳ型膠原酶濃度為0.25mg/ml分離效果最好；根據(jù)ICCs與其它胰腺細胞貼壁時間不同，以36h為分界線，可以進一步得到純化的胰島干細胞；在不同種類培養(yǎng)液和不同濃度的血清中，L-DMEM與15％小牛血清組合效果最佳。