體外胰島細(xì)胞共培養(yǎng)及化學(xué)因子聯(lián)合誘導(dǎo)NOD鼠iPSCs分化為胰島素分泌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:1型糖尿病是一種體內(nèi)胰島素絕對缺乏所導(dǎo)致的以高血糖為特征的終身性疾病，其發(fā)病率正在以3-5％的速度逐年提高。目前1型糖尿病患者在全球大約有2000萬，中國至少有100萬。1型糖尿病患者需終身胰島素治療以維持生命，目前尚沒有有效的手段根治1型糖尿病，不合理的胰島素補(bǔ)充所導(dǎo)致的高血糖或低血糖現(xiàn)象嚴(yán)重，以致各種并發(fā)癥接踵而至，患者壽命普遍縮短。
　　 為了有效控制血糖，防止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，提高糖尿病患者的生存質(zhì)量，替代被

2、患者自身免疫系統(tǒng)破壞的胰島素分泌細(xì)胞，胰島細(xì)胞移植蓬勃興起。而胰島細(xì)胞的移植仍面臨著兩大難題:一、供體來源不足，二、免疫抑制藥物的長期使用。自體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)由于不存在倫理和免疫排斥限制，有望成為誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞的種子細(xì)胞。但是iPSCs極低的誘導(dǎo)效率極大制約了其在臨床糖尿病治療中的應(yīng)用，如何安全高效地將自體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPSCs并誘導(dǎo)分化為有功能的胰島素分泌細(xì)胞成為制約這項(xiàng)技術(shù)發(fā)展的難點(diǎn)。
　　 非肥胖型糖尿病小

3、鼠(NOD mouse)來源于ICR鼠，是Makion等于1980年通過近親交配和選擇繁殖的一組具有白內(nèi)障傾向的自身免疫性糖尿病的動物模型，病狀的特征為尿頻、多飲、高血糖、尿酸強(qiáng)陽性、高膽固醇血癥，是目前人類研究1型糖尿病的良好動物模型。本實(shí)驗(yàn)利用反轉(zhuǎn)錄病毒將3個(gè)干細(xì)胞基因Oct4、Sox2、Klf4導(dǎo)入NOD鼠尾成纖維細(xì)胞中，將其誘導(dǎo)為NOD-iPSCs，并對其干細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)及全能性進(jìn)行了分析鑒定。由于摒棄了原癌基因c-Myc，高了

4、安全性。采用可拆分的半透膜相隔離設(shè)計(jì)——建立一個(gè)胰島細(xì)胞和iPSCs的共培養(yǎng)體系，在化學(xué)因子誘導(dǎo)分化的基礎(chǔ)上，讓胰島細(xì)胞更為精確地模仿胰腺生存的微環(huán)境，分泌可溶性因子作用于iPSCs。研究體外胰島細(xì)胞共培養(yǎng)及化學(xué)因子聯(lián)合誘導(dǎo)是否具有更高的效率，并為之后胰島素分泌細(xì)胞的分離純化、功能檢測、移植實(shí)驗(yàn)提供便利，建立優(yōu)化的技術(shù)平臺。
　　 第一部分
　　 目的:
　　 1.利用三因子(Oct4、Sox2、Klf4)構(gòu)建N

5、OD小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞系。
　　 2.對所獲得的iPSCs進(jìn)行鑒定及全能性分析，以期獲得與胚胎干細(xì)胞類似的多能干細(xì)胞。
　　 方法:
　　 1.制備逆轉(zhuǎn)錄病毒:包含Oct4，Sox2和Klf4三個(gè)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pMXs-Oct3、pMXs-Sox2、pMXs-Klf4及參照質(zhì)粒pMXs-EGFP購自Addgene公司，使用DH5α細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增后將4個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞Plat-E，48h后收

6、集病毒上清，過濾、濃縮后用于感染鼠尾成纖維細(xì)胞。
　　 2.分離與培養(yǎng)NOD鼠尾尖成纖維細(xì)胞(TTFs):無菌分離成年的NOD鼠尾真皮，37℃下5％ CO2孵育5d，在這期間成纖維細(xì)胞從尾組織中遷移出來，消化后接種至平皿培養(yǎng)。1-3代內(nèi)的細(xì)胞用于iPSCs的誘導(dǎo)。
　　 3.逆轉(zhuǎn)錄病毒感染TTFs及生成iPSCs:將收集的病毒上清感染生長良好的TTFs，約1周時(shí)可首次看到iPS克隆，20d左右iPS克隆可長至足夠大被挑取

7、擴(kuò)大培養(yǎng)。
　　 4.鑒定iPSCs的生物學(xué)特性:通過鏡下觀察、堿性磷酸酶染色、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、免疫熒光實(shí)驗(yàn)及畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)等對iPSCs形態(tài)、多能性基因表達(dá)情況、干細(xì)胞表面標(biāo)記及全能性等進(jìn)行鑒定分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.制備逆轉(zhuǎn)錄病毒:逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Plat-E細(xì)胞48h后，熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達(dá)(pMXs-EGFP)，轉(zhuǎn)染效率約在50-70％之間，細(xì)胞狀態(tài)良好。
　　 2

8、.分離與培養(yǎng)NOD-TTFs:TTFs原代培養(yǎng)在接種后3-4h貼壁，細(xì)胞呈長梭形、多邊形或不規(guī)則形，中間1-2個(gè)圓形或卵圓形的核，原代TTFs雜細(xì)胞較多，隨著傳代次數(shù)的增多，其純度增高，一般第二代后即可得到較純的細(xì)胞。
　　 3.逆轉(zhuǎn)錄病毒感染TTFs及生成iPSCs:包含三個(gè)干細(xì)胞基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染TTFs后大約一周左右可以在鏡下首次看到iPS克隆，而后克隆繼續(xù)增殖，12d左右形成肉眼可見的iPS集落，16-20d時(shí)克隆長至

9、足夠大，此時(shí)進(jìn)行挑取、消化、接種至飼細(xì)胞上傳代培養(yǎng)。
　　 4.鑒定NOD-iPSCs的生物學(xué)特性:從TTFs獲得的iPSCs鏡下觀察呈典型的克隆狀生長，圓形或橢圓形，與飼細(xì)胞分界清楚;RT-PCR、堿性磷酸酶染色及免疫熒光檢測iPSCs高表達(dá)胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因及蛋白;種植在免疫缺陷鼠體內(nèi)能夠形成向內(nèi)中外三個(gè)胚層分化的畸胎瘤，表明iPSCs具有多潛能性。未感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的TTFs不具有上述胚胎干細(xì)胞（embryonicstemc

10、ell，ESCs）相關(guān)的細(xì)胞特性。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過轉(zhuǎn)導(dǎo)三個(gè)重編程因子(Oct4、Sox2、Klf4)可以將NOD鼠尾尖成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞，即NOD-iPSCs。
　　 2.NOD-iPSCs具有類似胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性，并能維持長期多次傳代，表明初步建立了NOD-iPS細(xì)胞系。
　　 第二部分
　　 目的:
　　 1.體外將NOD-iPSCs誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞

11、。
　　 2.采用大鼠胰島細(xì)胞共培養(yǎng)及化學(xué)因子聯(lián)合誘導(dǎo)方法，建立一種更為安全、高效的誘導(dǎo)體系。
　　 方法:
　　 1.獲取共培養(yǎng)所需大鼠胰島細(xì)胞:6只SD大鼠隔夜禁食，麻醉后開腹后沿大鼠膽總管內(nèi)逆行注入預(yù)冷的0.5mg/ml膠原酶p溶液8～10ml，使胰腺膨脹，迅速摘取整個(gè)胰腺。用Ficoll非連續(xù)密度梯度離心法純化大鼠胰島細(xì)胞。將獲得的大鼠胰島細(xì)胞種植于培養(yǎng)皿中，1640培養(yǎng)基+10％澳洲胎牛血清+2％雙抗培

12、養(yǎng)。用雙硫腙(Dithizone，DTZ)染色檢測胰島的純度，吖啶橙(AcridineOrange，AO)-碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色檢測胰島的活率。
　　 2.誘導(dǎo)iPSCs分化為胰島素分泌細(xì)胞:
　　 實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)組:NOD鼠iPSCs+化學(xué)因子培養(yǎng)基+大鼠胰島細(xì)胞共培養(yǎng)對照組1:NOD鼠iPSCs+化學(xué)因子培養(yǎng)基對照組2:NOD鼠iPSCs+胰島細(xì)胞共培養(yǎng)+FP培養(yǎng)基培養(yǎng)，不加任何誘導(dǎo)

13、劑。
　　 對照組3:單獨(dú)培養(yǎng)NOD鼠iPSCs，不加任何誘導(dǎo)劑化學(xué)因子誘導(dǎo)法:
　　 第一階段:將iPSCs種植在Matrigel基質(zhì)膠(1∶50)包被的培養(yǎng)皿中，Dfl2培養(yǎng)基（補(bǔ)充0.2％ BSA，0.5×N2和0.5×B27）培養(yǎng)4天，同時(shí)加入誘導(dǎo)因子100 ng/ml activinA和1μM wortmannin將其誘導(dǎo)成內(nèi)胚層細(xì)胞。
　　 第二階段:第4天更換培養(yǎng)基為F12/IMDM（1∶1，補(bǔ)充0

14、.5％ BSA，0.5％ ITS和0.5×B27），并加入誘導(dǎo)因子2μM RA、20 ng/ml FGF7及50 ng/ml NOGGIN培養(yǎng)4天，將其誘導(dǎo)為胰島內(nèi)分泌細(xì)胞。
　　 第三階段:第8天更換培養(yǎng)基為高糖DMEM(補(bǔ)充0.5％ BSA，1％ ITS和1×N2)，并加入50 ng/ml EGF培養(yǎng)5天，促進(jìn)胰島祖細(xì)胞/胰島內(nèi)分泌細(xì)胞擴(kuò)增。
　　 第四階段:第13天更換培養(yǎng)基為DF12，并加入1％ ITS、10ng

15、/ml bFGF、10 mM nicotinamide、50 ng/ml Exendin-4和10 ng/ml BMP2培養(yǎng)7-9天，促進(jìn)胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞成熟。
　　 共培養(yǎng)方法:將iPSCs與大鼠胰島細(xì)胞以半透膜相隔離，使兩種細(xì)胞互不接觸，培養(yǎng)液可以相互交流，大鼠細(xì)胞分泌的可溶性因子可以自由通過半透膜。將iPSCs接種于12孔板底層，培養(yǎng)，孔板中置入transwell insert，在孔板上接種β細(xì)胞，insert直徑選0.4μ

16、m，保證細(xì)胞不能通過但培養(yǎng)液及可溶性因子可以通過。每10天更換一次新取大鼠胰島細(xì)胞。
　　 3.檢測胰島素分泌細(xì)胞相關(guān)指標(biāo):通過形態(tài)學(xué)觀察、雙硫腙染色、RT-PCR、免疫熒光染色以及葡萄糖刺激試驗(yàn)檢測誘導(dǎo)生成的細(xì)胞是否具有胰島素分泌細(xì)胞的相關(guān)功能。
　　 結(jié)果:
　　 1.形態(tài)學(xué)觀察及DTZ染色:誘導(dǎo)培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組及對照組1細(xì)胞逐漸聚集生長，約14天左右開始出現(xiàn)大小不一的細(xì)胞團(tuán)。第20天時(shí)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組Transwe

17、ll培養(yǎng)體系及對照組1各有20～30個(gè)細(xì)胞團(tuán)，形態(tài)不規(guī)則。富含鋅離子的細(xì)胞團(tuán)經(jīng)DTZ染色后呈棕紅色，其余細(xì)胞不著色。對照組2及對照組3未出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞不著色。
　　 2.RT-PCR檢測PDX-1表達(dá):實(shí)驗(yàn)組及對照組1誘導(dǎo)后的細(xì)胞從第8天開始表達(dá)PDX-1蛋白，并且從第8天至第20天表達(dá)逐漸增強(qiáng)。對照組2及對照組3未見PDX-1表達(dá)。
　　 3.葡萄糖刺激胰島素釋放試驗(yàn):實(shí)驗(yàn)組及對照組1細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)第4、8、12、16

18、、20天時(shí)，高糖刺激后可檢測到胰島素分泌，說明誘導(dǎo)后的細(xì)胞對葡萄糖刺激有反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)組和對照組1細(xì)胞誘導(dǎo)第8天時(shí)有微量胰島素分泌，且實(shí)驗(yàn)組高于對照組(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組和對照組1從第12天開始胰島素分泌明顯增加(第12天和第8天比，P＜0.05)，持續(xù)至第20天，第8天至第20天實(shí)驗(yàn)組胰島素分泌量均大于對照組，組內(nèi)第12天與第16、20天相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對照組2，對照組3培養(yǎng)上清中未測到胰島素分泌。證明實(shí)驗(yàn)組分泌胰島素最多，對葡

19、萄糖刺激反應(yīng)最大，且實(shí)驗(yàn)組早于其他組別產(chǎn)生胰島素分泌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.免疫熒光染色:實(shí)驗(yàn)組及對照組1誘導(dǎo)后第20天的細(xì)胞表達(dá)胰島素（綠色熒光）、C肽（紅色熒光）。對照組2、3細(xì)胞不表達(dá)上述各種蛋白。
　　 結(jié)論:
　　 1.NOD-iPSCs能夠在體外誘導(dǎo)生成類似體內(nèi)的胰島素分泌細(xì)胞，對高糖刺激有反應(yīng)，具有儲存分泌胰島素的功能。
　　 2.大鼠胰島細(xì)胞能分泌某些可溶性因子通過共培養(yǎng)體系加速分