將體細(xì)胞誘導(dǎo)為胰島素分泌細(xì)胞的初步研究.pdf

1、糖尿病是影響人類健康的主要疾病之一，分為1型和2型兩類。1型糖尿病患者胰島β細(xì)胞胰島素分泌缺陷，需要終生依賴外源性胰島素，一些2型糖尿病患者在服用降糖藥物無(wú)法控制血糖的情況下也需要依賴于胰島素，對(duì)此，最根本的治療方法是進(jìn)行胰腺移植或胰島細(xì)胞移植，但胰島來(lái)源短缺及需要終生服用免疫抑制劑等問(wèn)題限制了它的廣泛應(yīng)用。因此，尋找一種來(lái)源不受限制的人胰島細(xì)胞的替代物-即細(xì)胞替代治療，已成為近年來(lái)人們研究的焦點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中，選取了人胚胎腎細(xì)胞系（29

2、3T）和人胚胎成纖維細(xì)胞（hEFs）為靶細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)胰島素的分泌。 目的：利用基因工程的方法，將胰腺β細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入293T和hEFs中表達(dá)，使細(xì)胞程序重編為胰島素分泌細(xì)胞，并探究程序重編過(guò)程中的分子機(jī)制。 方法：擴(kuò)增胰腺β細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中三個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子Pdx-1，Ngn3和Pax4的開(kāi)放閱讀框，并連接到pAAV-MCS載體中。將構(gòu)建好的三個(gè)重組質(zhì)粒分別或兩兩組合或同時(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293T和hEFs細(xì)胞中

3、，恒溫箱培養(yǎng)48h后，從RNA水平和蛋白水平檢測(cè)293T和hEFs細(xì)胞是否有胰島素的分泌，并檢測(cè)細(xì)胞中胰島β細(xì)胞相關(guān)的基因的變化。 結(jié)果：?jiǎn)为?dú)轉(zhuǎn)染Pdx-1重組質(zhì)粒或Pdx-1與其他質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到293T細(xì)胞中，48h后，細(xì)胞中出現(xiàn)了胰島素的分泌。選取胰島素分泌量最多的組合方式處理hEFs細(xì)胞，細(xì)胞中同樣出現(xiàn)了胰島素的分泌。RT-PCR結(jié)果還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中出現(xiàn)了原本沒(méi)有表達(dá)的胰腺相關(guān)基因Ngn3，beta2和pc2的表達(dá)，此外免疫熒光結(jié)