人羊水來(lái)源干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞的研究.pdf

1、糖尿病依然是困擾人類(lèi)健康的重要疾病之一，目前，胰島細(xì)胞移植治療是較為理想的治療方法，然而供體的匱乏限制了這一治療手段的廣泛開(kāi)展。干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新及多向分化潛能的細(xì)胞，可以為細(xì)胞移植治療提供優(yōu)良的種子細(xì)胞，給胰島功能受損的糖尿病患者帶來(lái)了新的希望。然而胚胎干細(xì)胞及成體干細(xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，因受倫理限制或來(lái)源與數(shù)量的限制，使人們對(duì)尋找新的干細(xì)胞來(lái)源給與了更多的關(guān)注。最近幾年的研究顯示，羊水來(lái)源的干細(xì)胞(human amniot

2、icfluid-derived stem cells，hAFSCs)作為一種新的種子細(xì)胞來(lái)源，顯示了較好的優(yōu)勢(shì)：它們易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增，具有較低的免疫原性，體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)未見(jiàn)成瘤報(bào)道，具有多向分化潛能，可分化為骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞等。
　　 目前關(guān)于hAFSCs誘導(dǎo)分化為胰島細(xì)胞或胰島素分泌細(xì)胞的研究依然處于初期階段，相關(guān)論文僅一篇。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研，我們還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元限制性沉默因子(neuronalrestrictive sil

3、encing factor，NRSF)在干細(xì)胞向神經(jīng)和胰島分化過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用。胰島細(xì)胞中的配對(duì)盒基因4(paired box gene4，Pax4)、胰島-腦1(Islet-Brain1，IB1)/JNK相互作用蛋白1(JNK-interacting protein1，JIP-1)以及連接蛋白36(Connexin36)等基因的表達(dá)受到NRSF的調(diào)控。Pax4是決定胚胎時(shí)期內(nèi)分泌祖細(xì)胞定向分化為β細(xì)胞的重要的轉(zhuǎn)錄因子。IB1/

4、JIP-1和Connexin36分別是調(diào)控胰島β細(xì)胞的存活及分泌胰島素功能的重要成分。胰島細(xì)胞中存在著這些NRSF調(diào)控的靶基因提示著NRSF在胰島細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中可能扮演著重要的角色。此外，在胰島素瘤細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)NRSF會(huì)破壞其葡萄糖.胰島素分泌偶聯(lián)機(jī)制，而在胰島β細(xì)胞中表達(dá)NRSF則導(dǎo)致葡萄糖耐受和β細(xì)胞數(shù)目減少。因此，采用RNA干擾技術(shù)干涉hAFSCs中NRSF的表達(dá)，以使hAFSCs能夠分化為分泌胰島素的細(xì)胞，并為糖尿病的細(xì)胞移

5、植治療提供新的細(xì)胞來(lái)源，也就成了本實(shí)驗(yàn)研究的目的。
　　 研究分為兩部分：
　　 第一部分：人羊水來(lái)源干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與生物學(xué)性狀分析：
　　 方法：取孕中期產(chǎn)前診斷所抽取的羊水組織，離心收集細(xì)胞，然后培養(yǎng)擴(kuò)增。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察、姬姆薩顯帶核型分析、細(xì)胞增殖能力測(cè)定、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞免疫熒光染色及RT-PCR實(shí)驗(yàn)等對(duì)其基本生物學(xué)性狀，尤多能性標(biāo)志進(jìn)行了較為系統(tǒng)的分析。
　　 我們鑒定hAFSCs的多能性，主

6、要以胚胎干細(xì)胞已確證的干性標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)了階段特異性胚胎抗原4(stage specific embryonic antigen-4 SSEA-4)、Nanog與Oct4等的表達(dá)情況。SSEA-4是一種膜表面糖脂，主要表達(dá)在從受精卵到囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞及原始生殖細(xì)胞表面，隨發(fā)育進(jìn)行而逐漸減少，成體時(shí)主要表達(dá)在少數(shù)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上，是細(xì)胞全能性的重要標(biāo)志之一。Nanog是一種轉(zhuǎn)錄因子，開(kāi)始表達(dá)于桑葚胚細(xì)胞到囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞及原始生

7、殖細(xì)胞內(nèi)，后主要表達(dá)在外胚層細(xì)胞并隨發(fā)育的進(jìn)行而逐漸消失，其主要功能是參與胚胎干細(xì)胞全能性及胚胎外胚層亞全能性的維持，是細(xì)胞全能性的重要標(biāo)志之一。Oct4也是一種胚胎早期細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，是人多能干細(xì)胞的標(biāo)志之一，主要表達(dá)于人胚胎干細(xì)胞，原始生殖細(xì)胞內(nèi)。
　　 結(jié)果：原代羊水細(xì)胞可在5至14天形成細(xì)胞群落，細(xì)胞呈現(xiàn)兩種形態(tài)，一部分為成纖維細(xì)胞樣，一部分為上皮細(xì)胞樣，后者在傳代過(guò)程中逐漸消失，到第3代以后，細(xì)胞在形態(tài)上即可表現(xiàn)為較

8、為均一的成纖維細(xì)胞形態(tài)。在上述培養(yǎng)條件下hAFSCs具有良好的增殖能力，群體倍增時(shí)間約為36h；經(jīng)長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，核型保持穩(wěn)定；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，階段特異性胚胎抗原4(SSES-4)表達(dá)率可達(dá)80％以上，間充質(zhì)來(lái)源標(biāo)志CD29、CD90與CD105表達(dá)率可達(dá)90％以上，主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ類(lèi)抗原(MHC classⅠ，HLA-ABC)較強(qiáng)表達(dá)，而MHC classⅡ(HLA-DR)未檢測(cè)到表達(dá)；同時(shí)，免疫熒光等技術(shù)也證實(shí)hAFSC

9、s表達(dá)部分胚胎發(fā)育早期的標(biāo)志如SSES-4、Nanog、Oct4及Rex1。
　　 第二部分：神經(jīng)元限制性沉默因子在人羊水來(lái)源干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化中的作用研究：
　　 方法：構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白基因的NRSF干涉載體(siNRSF)與打散對(duì)照載體(siControl)，經(jīng)慢病毒介導(dǎo)感染hAFSCs。感染第3天利用定量PCR與western blot等技術(shù)檢測(cè)干涉效率。感染后的細(xì)胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)基下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)分為

10、兩個(gè)階段。在第7天與第14天，細(xì)胞經(jīng)RT-PCR與免疫熒光染色鑒定胰島發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)；在第14天用5.5mM與23mM葡萄糖刺激誘導(dǎo)后的細(xì)胞，用超敏ELISA試劑盒檢測(cè)C-肽釋放量及細(xì)胞內(nèi)的C-肽含量，用BCA法測(cè)定細(xì)胞總蛋白含量，并計(jì)算C-肽所占比例。
　　 結(jié)果：經(jīng)熒光顯微鏡觀(guān)察，慢病毒介導(dǎo)的感染效率可達(dá)90％以上，干涉載體導(dǎo)入羊水來(lái)源干細(xì)胞之后的第三天，細(xì)胞內(nèi)源性NRSF表達(dá)降低了70％左右，干涉效率明顯，同時(shí)RT-P

11、CR結(jié)果顯示胰島細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因Pax4表達(dá)上調(diào)，胰島素基因啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，胰島素基因也開(kāi)始微弱表達(dá)。在誘導(dǎo)后的第7天至第14天，胰島細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因，如.Pdx1，Isl-1，Nkx6.1都相應(yīng)表達(dá)，胰島素基因(Insulin)明顯表達(dá)。在誘導(dǎo)后的細(xì)胞中亦發(fā)現(xiàn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(Glut2)的表達(dá)，說(shuō)明誘導(dǎo)后的細(xì)胞可能具有葡萄糖感應(yīng)能力。在對(duì)照組中，雖然經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)，但未檢測(cè)到Pdx1，Isl-1，Nkx6.1，Insulin，

12、and Glut2的表達(dá)。經(jīng)免疫熒光染色顯示誘導(dǎo)后的細(xì)胞，Pdx1、胰島素與C-肽都能檢測(cè)到表達(dá)，而對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)表達(dá)。ELISA結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組C-肽胞內(nèi)含量約為1.24ng/mg，而對(duì)照組幾乎檢測(cè)不到。經(jīng)低濃度與高濃度葡萄糖刺激后，干涉組C-肽釋放量顯著高于對(duì)照組，且表現(xiàn)出了較好的葡萄糖應(yīng)答反應(yīng)。
　　 結(jié)論：hAFSCs是一群呈成纖維細(xì)胞樣，有良好增殖能力，較低免疫原性，且具有多向分化潛能的細(xì)胞。經(jīng)NRSF沉默與誘導(dǎo)培養(yǎng)基的