利拉魯肽在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞中的作用.pdf

1、目的：
　　 研究利拉魯肽是否具有促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBM-MSCs）向胰島素分泌細(xì)胞（IPCs）方向分化作用，確定其最佳誘導(dǎo)濃度和時(shí)間，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、采用高糖、尼克酰胺和利拉魯肽三階段誘導(dǎo)方案對(duì)體外擴(kuò)增培養(yǎng)的P5代hBM-MSCs進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化。具體方案為：先采用含25mmol/L葡萄糖的HG-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)10天；然后換為添加10mmol/L尼克酰胺的LG-DM

2、EM培養(yǎng)基培養(yǎng)7天；最后向LG-DMEM培養(yǎng)基中添加不同濃度（0.1、1、10、20、50nmol/L）利拉魯肽，分別刺激1、3、5、7、9天。采用ELISA法檢測(cè)利拉魯肽作用后各組細(xì)胞上清液中的胰島素含量，以確定其最佳作用濃度和時(shí)間。
　　 2、倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，并采用雙硫腙（DTZ）染色法鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞；采用Western Blot檢測(cè)各誘導(dǎo)階段細(xì)胞PDX-1、GLUT2、GK、胰島素蛋白表達(dá)情況；

3、ELISA檢測(cè)各誘導(dǎo)階段細(xì)胞的胰島素分泌水平及細(xì)胞對(duì)高糖刺激的反應(yīng)。
　　 結(jié)果：
　　 1、采用ELISA檢測(cè)不同濃度（0.1、1、10、20、50nmol/L）利拉魯肽刺激1、3、5、7、9天后的細(xì)胞胰島素分泌量，確定利拉魯肽的最佳作用濃度為10nmol/L，時(shí)間為7天。
　　 2、誘導(dǎo)前的hBM-MSCs形態(tài)為長(zhǎng)梭形，類似成纖維細(xì)胞外觀；誘導(dǎo)第一階段細(xì)胞開(kāi)始聚集，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，部分細(xì)胞變圓；第二階段細(xì)胞

4、體積變大、形態(tài)多樣，聚集生長(zhǎng)更為明顯，圓形細(xì)胞數(shù)量較第一階段有所增多，并呈半懸浮狀聚集生長(zhǎng)；至第三階段末出現(xiàn)大量圓形葡萄狀聚集生長(zhǎng)的胰島樣細(xì)胞團(tuán)。
　　 3、誘導(dǎo)前細(xì)胞DTZ染色陰性，誘導(dǎo)第一階段末出現(xiàn)少量DTZ染色陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性率約為1％；第二階段末DTZ染色陽(yáng)性細(xì)胞量增加，陽(yáng)性率約為4％；第三階段末細(xì)胞DTZ染色陽(yáng)性率約為8％。
　　 4、誘導(dǎo)前細(xì)胞PDX-1、GLUT2、GK、胰島素蛋白呈陰性表達(dá)；誘導(dǎo)三階段細(xì)胞P

5、DX-1、GLUT2、GK、胰島素蛋白的表達(dá)量逐漸增加（P＜0.05）。
　　 5、誘導(dǎo)前細(xì)胞上清液中幾乎檢測(cè)不出胰島素，其含量可忽略不計(jì)；誘導(dǎo)三階段細(xì)胞的胰島素分泌量逐漸增加，細(xì)胞對(duì)高糖刺激的反應(yīng)亦逐漸增加（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1、在體外，高糖、尼克酰胺聯(lián)合利拉魯肽，可使hBM-MSCs定向誘導(dǎo)分化為IPCs，并且添加10nmol/L利拉魯肽作用7天后可以使其誘導(dǎo)分化率明顯增加，細(xì)胞胰島素分泌