骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備移植用胰島素分泌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)旨在通過誘導(dǎo)分化和基因工程修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，從而獲得胰島素分泌細(xì)胞，可能會(huì)成為治療I型糖尿病的有效手段。 從健康成年志愿者骨髓中分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并在體外擴(kuò)增培養(yǎng)，一方面，在某些誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下分化為胰島p樣細(xì)胞。另一方面，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將外源性胰島素基因?qū)牍撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞，并穩(wěn)定表達(dá)和分泌胰島素，將此種基因工程修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到糖尿病大鼠模型體內(nèi)，能夠在一定程度上控制糖尿病。 整個(gè)研究分成四

2、個(gè)部分： 第一部分hMSCs的體外分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性。 目的：建立一種成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增的方法，并探討其部分生物學(xué)特性。 方法：利用密度為1．073的Percoll分離液，通過密度梯度離心法結(jié)合hMSCs貼壁生長(zhǎng)的特性，從成人紅骨髓中分離出hMSCs并接種于纖維連接蛋白包被、含有表皮生長(zhǎng)因子和血小板源性生長(zhǎng)因子BB的低濃度血清(2％FBS)培養(yǎng)液中擴(kuò)增，通過倒置顯微鏡、HE染色、掃描電鏡、

3、透射電鏡、流式細(xì)胞儀分析hMSCs的生物學(xué)特性。 結(jié)果：原代和傳代培養(yǎng)均保持較強(qiáng)的增殖能力，超微結(jié)構(gòu)顯示了干細(xì)胞的幼稚特性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示CD34、CD45、HLA-DR陰性，CDl0、CDl3、CD29、CD44陽性。 結(jié)論：采用該方法，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，擴(kuò)增較快。 第二部分hMSCs體外誘導(dǎo)分化成胰島素分泌細(xì)胞的初步研究。 目的：研究成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化成為胰島素分泌細(xì)胞的可能

4、性。 方法：采用Percoll分離液和差異貼壁法分離純化成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)傳代后，先后用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、B27添加劑、尼克酰胺等誘導(dǎo)，放免法檢測(cè)培養(yǎng)液中胰島素含量，雙硫腙和免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行體外細(xì)胞功能測(cè)定。 結(jié)果：誘導(dǎo)第二周細(xì)胞聚集成胰島樣細(xì)胞團(tuán)，開始分泌胰島素，雙硫腙染色成猩紅色，免疫熒光顯示細(xì)胞表達(dá)胰島素，體外葡萄糖刺激胰島素釋放試驗(yàn)陽性。 結(jié)論：成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外一定

5、條件下實(shí)現(xiàn)向胰島素分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。 第三部分外源性胰島素基因在hMSCs內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的研究。 目的：構(gòu)建攜帶人胰島素基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，使外源性人胰島素基因在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。 方法：通過RT-PCR法從人胰腺組織中獲得人胰島素基因，并將其連接入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX，經(jīng)過包裝細(xì)胞PT67的包裝后，獲得攜帶外源性人胰島素基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液(病毒滴度達(dá)4-6×106cfu／m1)。將攜帶外源性人胰

6、島素基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染hMSCs,經(jīng)過G418篩選出被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株并大量擴(kuò)增。利用RT-PCR法、免疫熒光法、放射免疫法、葡萄糖刺激試驗(yàn)分析被轉(zhuǎn)染的hMSCs對(duì)外源胰島素基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和分泌。 結(jié)果：攜帶人胰島素基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)導(dǎo)入hMSCs后能夠穩(wěn)定表達(dá)胰島素基因，并分泌至細(xì)胞外持續(xù)3周以上，對(duì)葡萄糖刺激試驗(yàn)陰性。 結(jié)論：人胰島素基因能夠被連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX中去，重組人胰島素基因逆轉(zhuǎn)錄病

7、毒能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)入hMSCs并穩(wěn)定表達(dá)。 第四部分：表達(dá)外源性胰島素基因的hMSCs移植治療大鼠糖尿病 目的：建立SD大鼠糖尿病模型，將穩(wěn)定表達(dá)人胰島素基因的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入糖尿病大鼠體內(nèi)，觀察治療糖尿病的效果。 方法：通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)健康SD大鼠建立糖尿病模型；將轉(zhuǎn)基因hMSC體外擴(kuò)增后注射到動(dòng)物模型的腎包膜下，檢測(cè)移植前后血糖、血清胰島素、C肽、體重、尿量、生存時(shí)間變化及腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn)(

8、IPGT)，以評(píng)價(jià)治療糖尿病的效果。 結(jié)果：STZ誘導(dǎo)大鼠后，大鼠血糖顯著上升，胰島素水平下降，出現(xiàn)典型的多飲、多食、多尿、體重下降等癥狀，生存時(shí)間縮短。將轉(zhuǎn)基因胰島素分泌hMSC移植到大鼠腎包膜下后，大鼠的血糖水平下降，胰島素、C肽、體重水平上升，糖尿病癥狀得到控制，生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，IPGT接近正常水平。 結(jié)論：轉(zhuǎn)基因hMSC在糖尿病大鼠體內(nèi)均可以合成與分泌有生物活性的胰島素，有效控制大鼠糖尿病癥狀，延長(zhǎng)生存時(shí)間。對(duì)