表達(dá)外源性人胰島素基因人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠糖尿病的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建攜帶外源性人胰島素基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)，獲得穩(wěn)定表達(dá)人胰島素基因的hMSCs，觀察移植治療大鼠糖尿病的療效。探討β細(xì)胞替代治療的細(xì)胞新來源。 方法：1.利用密度梯度離心法從健康成年人骨髓中分離出hMSCs進(jìn)行培養(yǎng)；2.通過RT-PCR法從人胰腺組織中提取人胰島素基因片段，將其連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX上，構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLNCX/hIns，經(jīng)過包裝細(xì)胞P67包裝

2、后獲得具有感染能力的病毒載體.；3.將重組表達(dá)載體pLNCX/hIns轉(zhuǎn)染hMSCs，G418抗性篩選出陽性克隆后培養(yǎng)擴(kuò)增，獲得成功轉(zhuǎn)染的hMSCs，利用RT-PCR法、免疫熒光法、放射免疫法檢測轉(zhuǎn)染后hMSCs對人胰島素基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，并進(jìn)行體外葡萄糖刺激釋放實(shí)驗(yàn)；4.通過腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)健康SD大鼠為糖尿病模型；5.將分泌胰島素hMSCs體外傳代擴(kuò)增后移植到糖尿病大鼠的腎包膜下，檢測移

3、植后血糖、血清胰島素、C肽、體重、尿量、生存時(shí)間及腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn)(IPGTT)等指標(biāo)，觀察治療大鼠糖尿病的效果；6.對移植物進(jìn)行病理學(xué)分析。 結(jié)果：成功構(gòu)建攜帶外源性人胰島素基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX/hIns。經(jīng)包裝細(xì)胞P67包裝后重組表達(dá)載體獲得感染能力，成功轉(zhuǎn)染hMSCs后，外源性人胰島素基因整合到hMSCs基因組中并可以穩(wěn)定表達(dá)。hMSCs在體外能夠持續(xù)合成與分泌胰島素。體外葡萄糖刺激釋放實(shí)驗(yàn)為陰性。大鼠在STZ誘導(dǎo)

4、后，血糖顯著上升，出現(xiàn)典型的多飲、多食、多尿、體重下降等癥狀，生存時(shí)間縮短。將分泌胰島素的hMSCs移植到大鼠腎包膜下后，大鼠的血糖水平下降，胰島素、C肽水平上升，體重增加，糖尿病癥狀得到控制，生存時(shí)間明顯延長，IPGTT接近正常水平。4周后在部分動(dòng)物模型的移植部位可見新生物長出，組織學(xué)分析可見典型的胰島樣結(jié)構(gòu)，免疫組化顯示胰島素染色陽性。 結(jié)論：通過重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX/hIns可以將外源性人胰島素基因?qū)雋MSCs中