轉(zhuǎn)染AKT1的骨髓間充質(zhì)干細胞與胰島聯(lián)合移植治療大鼠糖尿病的實驗研究.pdf

1、糖尿病是常見的內(nèi)分泌代謝疾病，其引發(fā)的多種并發(fā)癥嚴重危害人們的身心健康，只有建立內(nèi)源性胰島素分泌系統(tǒng)才能根治糖尿病。目前主要有胰腺移植和胰島移植兩種方法能達到此治療目的。胰島移植屬于細胞移植范疇，雖然目前胰島移植對外源性胰島素依賴性的解除不如胰腺移植高，但與胰腺移植相比具有安全、簡便、利于體外移植物修飾、不良反應(yīng)較低和可重復(fù)性等優(yōu)點，已成為很有發(fā)展前景的治療方法。 雖然如此，胰島移植仍存在需要解決的問題。第一，獲得高質(zhì)量的胰島是

2、移植成功的前提條件。目前胰島的提取方法很多，有常規(guī)分離法、膠原酶消化法和自動分離系統(tǒng)等。但就實驗角度來講，膠原酶消化分離、Ficoll梯度離心純化胰島仍然是比較理想的方法。第二，減輕排斥反應(yīng)是移植胰島長期存活的關(guān)鍵。因為胰島移植與胰腺移植不同的是，移植后直接暴露在受體的免疫系統(tǒng)攻擊下，因而很容易因排斥而失功。目前臨床常用的是非特異性的免疫抑制方案來減輕對移植物的排斥反應(yīng)，這些方案雖能相應(yīng)延長移植物的壽命，但同時也給機體增加了感染和腫瘤生

3、長的機會。 骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓中的一類非造血干細胞，在適宜的條件下能被誘導(dǎo)分化為多種組織細胞，而且其具有獨特的免疫學(xué)特性。一方面它沒有或有很低的免疫原性，不會刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這樣就可以逃避細胞毒性T細胞和NK細胞的殺傷；另一方面，它又有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，可以降低機體的免疫反應(yīng)，抑制T細胞的增殖。同時MSCs還是優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因載體。這意味著MSCs在移植領(lǐng)域

4、有重大的意義。 另外，若能有效的抑制凋亡、促進細胞的存活，也將對移植物長期發(fā)揮功能有利。AKT,亦稱蛋白激酶B(ptotein kinase B,PKB)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，AKT分子量為57KD，在細胞存活、細胞增殖、細胞代謝和細胞凋亡等活動中扮演著重要角色。根據(jù)其產(chǎn)生的組織特異性不同，將AKT分為三種亞型，即AKT1、AKT2、AKT3，它們之間的同源性可達82％。其中AKT1廣泛產(chǎn)生于各種組織中，能受多種激

5、活劑調(diào)節(jié)活化；AKT2也廣泛產(chǎn)生，并在卵巢癌和胰腺癌細胞中過量產(chǎn)生；AKT3主要在大腦和睪丸中產(chǎn)生。雖然AKT的作用機制目前尚有很多的未知領(lǐng)域，但AKT作為生存信號的一個重要的組件，隨著研究的深入，必將對今后的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用產(chǎn)生積極的影響?；贏KT與MSCs的上述特點，本實驗采用轉(zhuǎn)染AKT1的MSCs與胰島聯(lián)合移植來治療大鼠糖尿病，探討胰島長期存活的新方法。 材料與方法: 1.實驗動物：供提取MSCs的為一月齡Wi

6、star大鼠，雄性；供體為Wist-ar大鼠，雌雄不限，體重250-300g；受體為SD大鼠，雄性，體重200±5g。于移植前14d，用腹腔內(nèi)注射2％的鏈脲霉素(STZ，溶于pH值為4.5的檸檬酸緩沖液中，劑量為60 mg/kg)化學(xué)燒灼法制作SD大鼠1型糖尿病模型。剪尾測血糖，如果連續(xù)3d在非禁食狀態(tài)下血糖>16.7mmol/L，確定為糖尿病大鼠。將糖尿病大鼠隨機分為4組，糖尿病對照組6只，單純胰島移植組6只，干細胞和胰島聯(lián)合移植組1

7、2只，轉(zhuǎn)染AKT1的骨髓間充質(zhì)于細胞與胰島聯(lián)合移植組18只。 2.胰島提?。合蚬┦笠裙軆?nèi)原位逆行灌注膠原酶溶液(用冷的Hank's液配制，劑量為1.5mg/ml)10-12ml，使胰腺充分膨脹。切取后在37±1℃水浴中振蕩消化，消化時間12-15 min。水浴期間間斷加入1mol/L NaOH，使消化液的pH值保持在7.8±1。終止消化后，兩次離心洗滌，過20目篩。Ficoll梯度離心法純化胰島，濃度分別為25％、23％、20.

8、5％和11％，將內(nèi)含胰島懸浮物的11％及20.5％Ficoll液段抽出，RPMI-1640洗滌兩次備用。獲取的胰島用雙硫腙染色來判斷所提胰島的純度，胰島細胞數(shù)=3次樣品中DTZ陽性細胞團數(shù)÷3×20×樣本總量(ml)。吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)熒光染色法顯示細胞活率，體外葡萄糖刺激下胰島素釋放試驗檢測胰島活性。 3.MSCs培養(yǎng)：采用全血貼壁法培養(yǎng)。取一月齡Wistar大鼠的雙側(cè)股骨、脛骨和肱骨，無菌條件下沖出骨髓腔內(nèi)細胞，吹

9、打成單細胞懸液。接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放人37℃、5％CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)。記錄MSCs的生長狀況，繪制1、3、5代MSCs的生長曲線。選取P3代MSCs，用流式細胞儀三標抗體(CD34、CD44、CD90)檢測MSCs的表面標志。 4.AKT1構(gòu)建和轉(zhuǎn)染：取大鼠肝臟組織300 mg，提取總RNA，檢測RNA質(zhì)量后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，然后進行AKT1基因的PCR擴增。構(gòu)建真核表達載體，大量提取真核表達載體脂粒pcDN

10、A3-AKT1，并對其進行酶切鑒定。取處于對數(shù)生長期的MSCs，對其進行AKT1轉(zhuǎn)染。用RT-PCR和Western blot對轉(zhuǎn)染AKT1的MSCs進行檢測。 5.腎被膜下移植：首先將所要移植的內(nèi)容吸到微量加樣器中，離心，使胰島或/和MSCs(轉(zhuǎn)染或非轉(zhuǎn)染)匯集到加樣器前端。乙醚麻醉受者糖尿病大鼠。腹臥位，術(shù)區(qū)消毒，經(jīng)右側(cè)肋緣下斜切口入腹，顯露右腎，并將其拖出體外，用微量加樣器將胰島注射到腎被膜下，注射完畢后將腎還納回腹腔，關(guān)

11、腹，消毒術(shù)區(qū)。 5.1單純移植胰島組：注射約300IEQ的胰島。 5.2 MSCs和胰島聯(lián)合移植組：轉(zhuǎn)染AKT1組和未轉(zhuǎn)染AKT1組所移植的MSCs均為1×lO6個左右，分別與300IEQ胰島進行聯(lián)合移植。 5.3對照組糖尿病大鼠：注射相應(yīng)體積的1640溶液(約為15-20μl)。 6.血糖監(jiān)測：取尾血，用便攜式血糖儀檢測血糖。各組術(shù)后10d內(nèi)每日測量一次，以后每周2次。 7.胰島素檢測：MSCs

12、和胰島聯(lián)合移植組于術(shù)后4d和11d測量，以后每周一次。經(jīng)眶內(nèi)靜脈叢采血，每次取血約1ml，靜置，待血清析出后離心，取血清送檢。 8.0GTT：試驗前禁食12h-14h，用50％的葡萄糖以2g/kg的劑量灌胃，測定0、15、30、60、90及120min血糖。分別在血糖正常后3d、術(shù)后10d、術(shù)后30d測量。 9.形態(tài)學(xué)檢測：術(shù)后第10d各組處死6只；術(shù)后30d轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染組各處死6只；術(shù)后90d轉(zhuǎn)染組處死6只。取腎臟組織

13、作HE和Insulin-6免疫組織化學(xué)染色，觀察形態(tài)學(xué)變化及胰島存活情況。 10.統(tǒng)計學(xué)分析：將所得數(shù)據(jù)用均值±標準差表示。t檢驗進行處理，P<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1.胰島提?。浩骄恐淮笫罂色@得約600IEQ胰島,經(jīng)DTZ染色后，純度>90％。胰島活率>98％。體外葡萄糖刺激下胰島素釋放試驗表明，在低糖溶液中胰島素平均含量為80.7±6.3)μIU/ml，高糖溶液中胰島素平均含量為257.4±1

14、2μIU/ml，釋放指數(shù)(SI)為3.64±1.92。 2.大鼠MSCs 1、3、5代細胞生長曲線基本相同，形態(tài)趨于一直，經(jīng)流式細胞儀檢測MSCs的表面標志，熒光三標的結(jié)果均一性達到95％左右。CD44、CD90陽性，共同陽性率約為97％，CD34陰性，而此時CD90陽性率約為96％。 3.經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切電泳和質(zhì)粒測序證實本研究構(gòu)建的AKT1表達載體構(gòu)建成功，經(jīng)Iipofectamine 2000轉(zhuǎn)染MS

15、Cs，RT-PCR及Western檢測結(jié)果顯示，在MSCs中已表達AKT1基因的mRNA和蛋白。 4.血糖監(jiān)測、胰島素水平和OGTT：各組糖尿病大鼠移植當天血糖既開始下降，3d后血糖下降至正常。(1)單純胰島移植組：胰島存活時間在6d左右。血糖正常3d天后進行口服糖耐量試驗，曲線介于正常大鼠與糖尿病大鼠之間，其它兩組曲線也與此相似。由于取血量的限制，沒對此組做胰島素檢測。(2)干細胞與胰島聯(lián)合移植組：血糖維持平穩(wěn)持續(xù)時間大約在2

16、5d，胰島素分泌量與血糖分泌相協(xié)調(diào)。第二次OGTT與正常大鼠沒有統(tǒng)計學(xué)差異，而第三次已經(jīng)有下降趨勢。(3)轉(zhuǎn)染AKT1的MSCs與胰島聯(lián)合移植組：血糖水平、胰島素水平及后兩次OGTT水平均較正常無明顯區(qū)別。 5.形態(tài)學(xué)檢測： 首次取材：單純移植組排斥反應(yīng)較明顯，胰島細胞胰島素分泌少；其余兩組胰島素分泌較多。第二次取材：干細胞組已有排斥反應(yīng)，胰島素分泌減少；轉(zhuǎn)染組較以前無明顯變化。第三次取材：轉(zhuǎn)染組仍沒有明顯的變化。