人脂肪間充質干細胞向胰島素分泌細胞分化體系的建立和優(yōu)化及miR-375過表達對分化的影響.pdf

1、糖尿病是一種常見的嚴重代謝性疾病，而胰島移植是目前效果最好的治療方法，但是胰島來源匱乏嚴重制約了該療法的使用。通過定向誘導或基因工程的方法可以使非胰β細胞具有胰島素分泌功能，從而代替胰β細胞用于糖尿病的細胞治療，為糖尿病患者帶來了新希望。本研究以脂肪間充質干細胞為研究對象，建立了誘導其形成胰島素分泌細胞的分化體系并研究了miR-375過表達對分化的影響，為脂肪間充質干細胞在糖尿病治療中的應用奠定了基礎。
　　本研究主要內容包括：⑴

2、基于胚胎干細胞分化為胰島素分泌細胞（insulin producing cells，IPCs）期間的關鍵步驟和規(guī)律，以及前期對人脂肪間充質干細胞(human adipose tissue-derived mesenchymal stem，haMSCs)胰向分化的探索，確立五種含有不同誘導因子的分化方案。通過使用這五種方案分別對脂肪間充質干細胞進行誘導分化以及對分化細胞進行基因表達檢測和細胞形態(tài)學比較，最終確定了以第一階段添加小分子CYC

3、、NOGGIN、B27和RA的基礎高糖培養(yǎng)液;第二階段添加Nic、GLP1、NOGGIN和B27的基礎高糖培養(yǎng)液;第三階段添加Nic、GLP1、IGF1和NOGGIN的IMDM培養(yǎng)液的三階段分化方案為最優(yōu)分化方案。我們通過使用該方案成功誘導haMSCs分化為IPCs，分化細胞表達胰腺相關基因Foxa2、Pdx1、Ngn3、Ins和Gcg，細胞胰島素免疫熒光染色為陽性，分泌胰島素的ELISA檢測為陽性。并發(fā)現(xiàn)BMP信號通路對胰島素分泌細胞

4、的形成有調節(jié)作用，NOGGIN的加入有促進Ins表達的作用。實驗室所保存的人臍帶間充質干細胞(humanumbilical cord mesenchymal stem cells，hucMSC)可以作為haMSC分化過程中同期處理的對照細胞。⑵miR-375在胰腺、胰島細胞發(fā)育和成熟起到重要的調控作用，控制其表達可能有助于干細胞向胰島素分泌細胞分化。為了探究基于前期建立的誘導分化方案過表達miR-375后對分化究竟有何影響，我們利用慢病

5、毒載體，成功構建穩(wěn)定過表達miR-375的haMSC細胞株，并將其誘導分化為IPCs;同時，我們構建了一種在分化第三階段瞬時過表達/抑制miR-375的脂質體轉染體系，來探究過表達/抑制miR-375后對haMSC分化的影響。通過以上兩種方法，得出:miR-375和Ins表達呈正相關;過表達miR-375可以降低分化所得細胞中Gcg的表達;在分化第三階段起始瞬時過表達miR-375可以上調Ngn3; mi-375過表達對Pdx1、Fox