人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化體系的建立和優(yōu)化及miR-375過(guò)表達(dá)對(duì)分化的影響.pdf

1、糖尿病是一種常見(jiàn)的嚴(yán)重代謝性疾病，而胰島移植是目前效果最好的治療方法，但是胰島來(lái)源匱乏嚴(yán)重制約了該療法的使用。通過(guò)定向誘導(dǎo)或基因工程的方法可以使非胰β細(xì)胞具有胰島素分泌功能，從而代替胰β細(xì)胞用于糖尿病的細(xì)胞治療，為糖尿病患者帶來(lái)了新希望。本研究以脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對(duì)象，建立了誘導(dǎo)其形成胰島素分泌細(xì)胞的分化體系并研究了miR-375過(guò)表達(dá)對(duì)分化的影響，為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在糖尿病治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴

2、基于胚胎干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞（insulin producing cells，IPCs）期間的關(guān)鍵步驟和規(guī)律，以及前期對(duì)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose tissue-derived mesenchymal stem，haMSCs)胰向分化的探索，確立五種含有不同誘導(dǎo)因子的分化方案。通過(guò)使用這五種方案分別對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化以及對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較，最終確定了以第一階段添加小分子CYC

3、、NOGGIN、B27和RA的基礎(chǔ)高糖培養(yǎng)液;第二階段添加Nic、GLP1、NOGGIN和B27的基礎(chǔ)高糖培養(yǎng)液;第三階段添加Nic、GLP1、IGF1和NOGGIN的IMDM培養(yǎng)液的三階段分化方案為最優(yōu)分化方案。我們通過(guò)使用該方案成功誘導(dǎo)haMSCs分化為IPCs，分化細(xì)胞表達(dá)胰腺相關(guān)基因Foxa2、Pdx1、Ngn3、Ins和Gcg，細(xì)胞胰島素免疫熒光染色為陽(yáng)性，分泌胰島素的ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性。并發(fā)現(xiàn)BMP信號(hào)通路對(duì)胰島素分泌細(xì)胞

4、的形成有調(diào)節(jié)作用，NOGGIN的加入有促進(jìn)Ins表達(dá)的作用。實(shí)驗(yàn)室所保存的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilical cord mesenchymal stem cells，hucMSC)可以作為haMSC分化過(guò)程中同期處理的對(duì)照細(xì)胞。⑵miR-375在胰腺、胰島細(xì)胞發(fā)育和成熟起到重要的調(diào)控作用，控制其表達(dá)可能有助于干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化。為了探究基于前期建立的誘導(dǎo)分化方案過(guò)表達(dá)miR-375后對(duì)分化究竟有何影響，我們利用慢病

5、毒載體，成功構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-375的haMSC細(xì)胞株，并將其誘導(dǎo)分化為IPCs;同時(shí)，我們構(gòu)建了一種在分化第三階段瞬時(shí)過(guò)表達(dá)/抑制miR-375的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體系，來(lái)探究過(guò)表達(dá)/抑制miR-375后對(duì)haMSC分化的影響。通過(guò)以上兩種方法，得出:miR-375和Ins表達(dá)呈正相關(guān);過(guò)表達(dá)miR-375可以降低分化所得細(xì)胞中Gcg的表達(dá);在分化第三階段起始瞬時(shí)過(guò)表達(dá)miR-375可以上調(diào)Ngn3; mi-375過(guò)表達(dá)對(duì)Pdx1、Fox