脂肪間充質干細胞的基礎研究和臨床應用探討.pdf

1、間充質干細胞屬于一種多能干細胞,其不但可以分化成多個胚層組織細胞,而且還具有顯著的免疫調(diào)節(jié)特性,因此,無疑成為組織工程和治療免疫因素介導疾病的良好工具。骨髓雖然是間充質干細胞最常見來源,但取材復雜,獲取困難。國內(nèi)外眾多學者已在成體的多種組織中分離出類似骨髓源間充質干細胞的細胞亞群。脂肪組織作為最容易獲得的成體組織,可能成為最具吸引力、能夠分離間充質干細胞的備選組織之一。
　　 本研究的第一部分旨在研究成體脂肪組織中是否和骨髓一樣

2、也存在具有多能性的間充質干細胞。我們通過運用免疫磁珠分選和極限稀釋的方法,從成體脂肪組織中分離得到-Flk1+CD31-CD34-的多能干細胞的亞群,誘導分化實驗顯示,該細胞在單細胞水平上體外可以向脂肪細胞、成骨細胞及肝上皮樣細胞定向分化。免疫表型分析的結果顯示,這些細胞高表達Flk1、CD105、CD44及CD29,但不表達vWF、CD31、CD34、CD45、CD11a、CD11b、CD117、HLA-ABC及HLA-DR。這與骨髓

3、來源的Flk1+CD31-CD34-成體干細胞的表型基本一致；瑞氏-吉姆薩染色后可見,脂肪來源的干細胞,形態(tài)上也基本與骨髓源Flk1+CD31-CD34-多能干細胞相似,呈成纖維樣；在對數(shù)生長期,細胞倍增時間與骨髓源Flk1+CD31-CD34-多能干細胞也基本一致,約為28小時。另外,我們的結果同時也提示,與骨髓源干細胞的分離純化相比,從同一體積的脂肪組織分離得到的成纖維樣集落細胞的數(shù)量是骨髓的10倍以上。既然骨髓源Flk1+CD31

4、-CD34-細胞和脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞具有相同的功能,成體脂肪組織就應該更具應用前景。
　　 第二部分旨在探討體外定向誘導成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞向胰島樣細胞分化的可能性。首先將成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞培養(yǎng)在含適當濃度的B27、bFGF及EGF等因子的培養(yǎng)基中進行誘導,接著更換誘導培養(yǎng)基,采用含有適當濃度的β細胞調(diào)節(jié)素、尼克酰胺等高糖無血清培養(yǎng)基誘導細胞向胰島樣細胞分化

5、,然后用RT-PCR法檢測誘導前后nestin,ngn3,IPF-1,胰島素,胰高血糖素基因的表達；用免疫組織化學法檢測誘導前后nestin,胰島素,胰高血糖素蛋白的表達；放射免疫分析法檢測誘導前后細胞分泌胰島素情況。結果發(fā)現(xiàn):成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞經(jīng)過第一階段誘導后可分化成nestin陽性的祖細胞,再繼續(xù)誘導6d后變圓的細胞逐漸增多,且聚集成團,免疫熒光實驗證明經(jīng)過這兩個階段誘導后的細胞能夠表達胰島素、胰高血糖素

6、、生長抑素等內(nèi)分泌激素,放免分析結果表明誘導的胰島樣細胞團能夠分泌胰島素。因此,成人脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞具有胰腺干祖細胞的固有特征,極有可能作為種子細胞用于糖尿病的細胞治療。
　　 本論文的第三部分旨在探索成體脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞作為滋養(yǎng)層能否促進造血細胞的增殖、分化,以及體內(nèi)脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞能否促進機體造血功能恢復。以脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞為滋養(yǎng)

7、層,接種造血細胞,觀察細胞數(shù)及CFLJ-GM的變化。將脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞通過尾靜脈輸給預先經(jīng)137Cs全身照射0.35Gy的雌性C57BL/6小鼠,定期檢測外周血和骨髓細胞的總數(shù)以及CFU-GM變化。體外實驗的結果提示:實驗組造血細胞總數(shù)及CFUJ-GM值在第2周即明顯的高于對照組,脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞能夠有效地支持造血細胞增殖及分化達6廚；體內(nèi)實驗結果提示:聯(lián)合輸注脂肪源Flk1+CD31-C

8、D34-細胞的實驗組小鼠,其外周血和股骨有核細胞數(shù)、CFLJ-GM值于第2周即明顯的高于單純照射組小鼠,第4周實驗組小鼠部分骨髓細胞有Y染色體的表達,提示在受體內(nèi)有供體細胞存在。因此,脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞能夠促進照射小鼠的造血恢復。
　　 本論文的第四部分探討器官移植中脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞誘導免疫耐受的可能性。以CM-DM熒光染料示蹤脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞在體內(nèi)的分布情況

9、,并以PCR的方法檢測Y染色體的存在以進一步鑒定；以皮膚移植實驗觀察脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞移植組小鼠對供者來源組織器官移植物的反應性。結果發(fā)現(xiàn):脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞可以進入并較長期(30天)存在于異基因小鼠的免疫器官內(nèi):在細胞移植組小鼠脾臟中可檢測到供者來源的T細胞占受者脾臟細胞的6.68％；脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞移植組的小鼠供者來源皮膚移植物存活>90d,未處理組平均為10d。因

10、此,異基因脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞移植后可形成穩(wěn)定的嵌和體,并誘導特異性的免疫耐受產(chǎn)生。
　　 本論文的第五部分,通過重建端粒酶活性延長脂肪源Flk1+CD31-CD34-干細胞的壽命,并對它的成骨潛能進行研究,以期為骨組織工程提供種子細胞。首先,將人端粒酶催化亞基(hTERt)基因通過脂質體轉染法導入脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞,RT-PCR檢測hTERT mRNA的表達,TRAP-PCR檢測細胞端

11、粒酶的活性。Von Kossa染色及RT-PCR檢測已重建端粒酶活性的脂肪源干細胞向成骨細胞的分化潛能。結果發(fā)現(xiàn):轉染hTERT的脂肪源干細胞能夠穩(wěn)定地表達端粒酶活性。轉染后傳75代的細胞仍能維持著自我更新及向成骨細胞分化的潛能,且無惡性轉化傾向。因此,我們的結果提示,重建端粒酶活性可延長脂肪源干細胞的壽命并能維持其自我更新及成骨潛能,從而為建立骨組織工程標準細胞系提供新的實驗手段。
　　 本論文的第六部分,對6例發(fā)生慢性肝臟G

12、VHD的患者進入臨床評估?；颊咴诃h(huán)孢霉素和糖皮質激素治療無效后改用FK506治療慢性肝臟GVHD,然而,若干天后,患者又出現(xiàn)了進行性腎功能受損,因此,停用FK506改用異基因脂肪源Flk1+CD31-CD34-細胞,相關生化檢測指標顯示,肝臟GVHD及腎功能受損很快得以緩解?，F(xiàn)在,該6名患者生存狀況良好。
　　 本論文的第七部分旨在進一步評價成人脂肪源干細胞作為挽救方案用于對糖皮質激素耐藥的急性移植物抗宿主病的治療。6例對糖皮質

13、激素耐藥的Ⅲ～Ⅳ度急性移植物抗宿主病患者均經(jīng)靜脈輸入成人脂肪源干細胞(劑量為1.0×106/kg),其中1例患者接受兩次成人脂肪源干細胞的輸注,其余5例患者均接受一次成人脂肪源干細胞治療。在這6例患者中,2例患者接受的成人脂肪源干細胞來源于HLA配型完全相合的家庭供著,其余4例患者接受無血緣關系的無關供者的成人脂肪源干細胞。結果:所有接受成人脂肪源干細胞治療的6例患者均無明顯副作用出現(xiàn)；在接受成人脂肪源干細胞治療的6例患者中,除1例患者