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文檔簡介
1、感音神經性聾主要由耳蝸毛細胞或聽覺神經病變引起。毛細胞位于耳蝸內,是高度特異性機械感受器,其功能障礙、損傷甚至缺失是耳蝸病變引起感音神經性聾的主要原因。相對于非哺乳動物,哺乳動物毛細胞損傷后不能自發(fā)再生,由此引起的聽力損失難以恢復。應用干細胞進行細胞替代治療是毛細胞缺失后恢復聽力的一個主要治療策略。骨髓間充質干細胞易于收集和增殖、能夠自體移植、無臨床應用倫理問題和免疫障礙,具有多潛能性,是目前進行干細胞替代治療的主要干細胞來源。體外研究
2、顯示骨髓間充質干細胞在一定細胞蛋白作用下具有很強的可塑性,能夠分化為神經元細胞類型。但是,骨髓間充質干細胞能否分化為內耳毛細胞或前體細胞,干細胞移植到內耳能否存活和分化,能否替代損傷的聽毛細胞,這些都還不清楚。
本課題對大鼠骨髓間充質干細胞體外定向誘導分化耳蝸毛細胞和骨髓間充質干細胞內耳導入正常和藥物性聾耳蝸內的存活和分化情況進行了研究。本研究共分為兩部分:
第一部分 骨髓間充質干細胞體外誘導分化為毛細胞樣細
3、胞
目的:探討骨髓間充質干細胞體外定向分化為耳蝸毛細胞的可行性。
方法:1、體外分離培養(yǎng)骨髓間充質干細胞,觀察不同換液方式對骨髓間充質干細胞純化和增殖的影響;RT-PCR檢測培養(yǎng)細胞表面分子表達;定向誘導培養(yǎng)細胞向成脂細胞、成骨細胞方向分化。2、采取不同細胞誘導因子定向誘導培養(yǎng)骨髓間充質干細胞地向分化為內耳毛細胞,培養(yǎng)后細胞進行免疫組化鑒定和掃描電鏡觀察。
結果:1、24小時首次半量換液可使分離
4、細胞在7天內迅速增殖鋪滿細胞培養(yǎng)皿,培養(yǎng)細胞表面分子SH2、CD31、CD44呈陽性表達,但不表達CD34,培養(yǎng)細胞可分別向脂肪細胞及成骨方向分化。2、體外骨髓間充質干細胞誘導后呈現神經干細胞樣形態(tài)并表達其特異性標志Nestin,繼續(xù)誘導分化表達內耳毛細胞特異性標志MyosinⅦa,電鏡觀察可見細胞表面長出微絨毛,類似毛細胞的靜纖毛。
結論:1、24小時首次半量換液培養(yǎng)有利于大鼠骨髓間充質干細胞的分離和純化,培養(yǎng)細胞證實為
5、骨髓間充質干細胞。2、骨髓間充質干細胞體外可定向誘導分化為內耳毛細胞樣細胞。
第二部分 骨髓間充質干細胞內耳移植治療藥物性聾
目的:1.探討用于干細胞替代治療研究的感音神經性聾動物模型的建立方法;2.觀察骨髓間充質干細胞移植對正常耳蝸的影響;3.研究骨髓間充質干細胞移植到藥物性聾耳蝸內的存活和分化情況。
方法:1、應用不同劑量阿米卡星連續(xù)1周,通過聽覺腦干反應閾值、耳蝸常規(guī)切片和掃描電鏡觀察,確
6、定適合用于骨髓間充質干細胞移植的感音神經性聾大鼠動物模型。2、經鼓階途徑將骨髓間充質干細胞移植到正常聽力大鼠耳蝸內,通過聽覺腦干反應閾值、耳蝸常規(guī)切片觀察骨髓間充質干細胞移植對耳蝸結構和功能的影響。3、經鼓階途徑將骨髓間充質干細胞移植到藥物性聾大鼠耳蝸內,通過聽覺腦干反應閾值、免疫組化和掃描電鏡觀察植入細胞對感音神經性聾聽功能的影響及植入細胞在耳蝸內的分化情況。
結果:1、應用阿米卡星按500mg·kg-1·d-1進行連續(xù)
7、一周皮下注射,可造成大鼠聽覺永久性閾移,3周后觀察柯替器毛細胞缺失,支持細胞損傷,呈現立方上皮樣結構。2、骨髓間充質干細胞鼓階導入對正常大鼠聽功能和耳蝸結構無明顯影響,可在鼓階和前庭階內貼壁或游離存活至少4周。3、骨髓間充質干細胞移植到藥物性聾動物耳蝸內可遷移到耳蝸基底膜處并具有聽毛細胞特征,移植后8周聽功能大多無明顯改善。
結論:1、應用阿米卡星可以建立起適合骨髓間充質干細胞替代治療的理想動物模型。2、骨髓間充質干細胞移
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