胸腺對胚胎干細胞向胰島素分泌細胞分化過程中不同階段細胞MHC表達的影響.pdf

1、目的:
　　研究胸腺上皮細胞對胚胎干細胞向胰島素分泌細胞分化的各個階段細胞MHC分子表達的影響，努力尋找一種能降低胚胎干細胞來源的成熟細胞免疫原性的方法，為干細胞移植治療抗移植排斥策略提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的制備:取e13.5天的孕小鼠，用75％酒精消毒后充分剪碎(1-3mm3)，再用0.25％胰酶(Trypsin)-0.02％EDTA溶液消化成細胞懸液，制備成小鼠胚胎成

2、纖維細胞(MEF)。
　　2.胚胎干細胞(ESC)的擴增:小鼠胚胎干細胞(ESC)接種于經(jīng)絲裂霉素處理的飼養(yǎng)層MEF上，在含15％胎牛血清、1000IU/ml白血病抑制因子(LIF)、DMEM高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每3-4天按1:3-4比例傳代擴增一次。
　　3.ESC向IPC分化誘導(dǎo):
　　3.1擬胚體(embryonic bodies，EB)的形成:將培養(yǎng)3-4天的ESC用0.25％胰酶(Trypsin)-0.02％E

3、DTA消化為單細胞后，接種子低粘附性的細菌培養(yǎng)皿，懸浮培養(yǎng)4-5天，使ESC自發(fā)分化為EB。
　　3.2 nestin陽性細胞(nestin positive cells，NPC)的形成:收集培養(yǎng)4-5天的EB，轉(zhuǎn)接于Ⅰ型膠原蛋白包被過的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24小時，EB貼壁后更換為無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，添加N2、纖維連接蛋白、bFGF。連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3天可形成NPC。
　　3.3胰島素分泌細胞(insulin-prod

4、ucing cells，IPC)的形成:NPC形成后，更換為含肝細胞生長因子、活化素-A、β-細胞素、煙酰胺、bFGF和不含血清的DMEM/F12的IPC誘導(dǎo)培養(yǎng)液，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，至第4天，培養(yǎng)液中添加10mmol/L濃度的葡萄糖，24小時后更換為含葡萄糖20mmol/L的新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至IPC形成并聚集為胰島樣細胞團（islet-like cell clusters，ICCs）。
　　4.小鼠胸腺上皮細胞的分離:

5、　　(1)酶消化法:無菌取小鼠胸腺，充分剪碎(1-3mm3)，加0.25％胰蛋白酶消化液，37℃水浴，離心，棄上清，加0.2％膠原酶，37℃水浴，棄上清，用比重為1.077的細胞分離液分離，取第二條條帶接種于細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，24小時后，第一次換液，以后每3天換一次液。細胞經(jīng)HE染色和免疫組化染色鑒定。
　　(2)組織快法:取小鼠胸腺組織，剪碎，直接放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加適量培養(yǎng)液培養(yǎng)，3天后換液，待上皮細胞爬滿瓶后，可傳代凍存。細

6、胞經(jīng)HE染色和免疫組化染色鑒定。
　　5.小鼠胸腺細胞上清的制各:無菌取胸腺組織，剪碎，酶消化，中和離心后，直接將細胞以1×106/ml接種到培養(yǎng)瓶。8小時后收集瓶中懸浮細胞（去除貼壁的上皮細胞和成纖維細胞），離心后將細胞重懸，以1×106/ml細胞密度加入無血清DMEM培養(yǎng)（排除血清中未知因子對實驗的干擾），培養(yǎng)24小時收集細胞懸液，離心后去細胞，取上清液保存?zhèn)溆谩?br>　　6.胸腺上皮細胞與EB共培養(yǎng)及ES向IPC定向分化的

7、誘導(dǎo):ESC培養(yǎng)3-4天后，轉(zhuǎn)接于用胸腺上皮細胞包被過的培養(yǎng)瓶，誘導(dǎo)培養(yǎng)至ICC形成。
　　7.共培養(yǎng)各階段免疫原性檢測:與胸腺上皮細胞共培養(yǎng)的EB、NPC、IPC和ICC，用MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗體處理后流式細胞儀(FCM)分析，檢測MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子表達情況。
　　8.胸腺細胞培養(yǎng)上清液對EB向IPC分化及MHC表達的影響:ESC培養(yǎng)3-4天后，等量接入用Ⅰ型膠原蛋白包被過的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶分三組，分別加入20％

8、、40％和60％的胸腺細胞上清液，誘導(dǎo)至ICC形成。
　　9.條件培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞各階段免疫原性檢測:添加胸腺細胞上清的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)的EB、NPC、IPC和ICC，用MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗體處理后流式細胞儀(FCM)分析，檢測MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.本實驗?zāi)塬@得增殖能力旺盛及純化的MEF飼養(yǎng)層。采用MEF和LIF相結(jié)合的方法培養(yǎng)ESC，ESC擴增能力強，能長時間維持干細胞特性。

9、>　　2.實驗采用分階段誘導(dǎo)方法，在胸腺上皮細胞共培養(yǎng)的條件下，ESC也可以正常誘導(dǎo)分化為胰島樣細胞團。
　　3.在胸腺上皮細胞分離時，采用酶消化法在細胞培養(yǎng)4天后可見少量上皮細胞。組織塊法培養(yǎng)一周左右，組織塊周圍爬出大量上皮細胞?？棄K法比酶消化法方便簡單，通過長時間培養(yǎng)能獲取更多的胸腺上皮細胞。
　　4.經(jīng)HE染色和免疫組化染色，胸腺上皮細胞細胞形態(tài)不一，呈三角或多角形，彼此緊密相接呈鋪磚樣排列，免疫組化CK8蛋白著色的陽

10、性部位位于胞質(zhì)區(qū)。
　　5.EB與胸腺上皮細胞或不同濃度的胸腺細胞上清共培養(yǎng)后，隨著分化的不同階段，MHC-1和MHC-Ⅱ分子表達都逐漸降低。
　　結(jié)論:
　　1.EB與胸腺上皮細胞共培養(yǎng)不影響EB向胰島樣細胞團分化。
　　2.在與胸腺上皮細胞共培養(yǎng)中，和對照組相比，MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表達在EB、NPC階段較高，無統(tǒng)計學意義，在IPC、ICC階段MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子表達比對照組低，統(tǒng)計學有意義，故認