CPED1基因在雞胚胎干細胞向精原干細胞分化過程中的作用.pdf

1、分類號Ⅲ㈣l ＼10 7埸- H 1 大季Y A N G Z H O U U N I V E R S I T Y學號M 1 4 8 9 3密 級碩士學位論文( 全日制學術學位)C P E D l 基因在雞胚胎干細胞向精原干細胞分化過程中的作用王飛指導教師姓名： 奎翌盔塹撞：揚劃盤鱟! 姿菱揚劌：2 2 三Q Q 窆中請學位級別： 亟 ± 學科專業(yè)名稱：動塹逮堡直獨當繁殖論文提交日期： 2 Q ! Z 生魚月論文答辯口期： 2

2、Q 12 生主旦2 2 旦學位授予單位： 揚劌盤堂 學位授予日期： 2 Q 12 生魚旦2 Q 旦答辯委員會主席： 塑垂揸塹撞2 0 1 7 年6 月C P E D l 基因在雞胚胎干細胞向雄性生殖細胞分化中的作用C P E D l 基因在雞胚胎千細胞向精原干細胞分化過程中的作用} 兩要精原干細胞( s p e n n a t o g o n i a l s t e m c e l l s ，S S C s ) 是動物體內(nèi)重要的成體干細

3、胞，能夠?qū)⑦z傳物質(zhì)傳遞給下一代，它既有胚胎干細胞的發(fā)育特性又能發(fā)育成單倍體生殖細胞?，F(xiàn)今有大量研究表明精原干細胞可在體外被誘導為具有不同功能的細胞系，用于遺傳修飾、疾病治療和轉基因動物制備等，因此對精原干細胞體外操作的研究尤為重要。其中將S S C s 誘導形成精子一直是科學家們研究的熱門話題，但如何大量獲得S S C s 并使其產(chǎn)生具有功能性的精子就成為科學家們亟需解決的科學問題。通過本課題組前期已完成的雞雄陛E S C s ，雄陛P

4、 G C s 以及S S C s 的轉錄組測序( R N A ．S e q ) 的實驗結果，分析得到了雞雄性生殖細胞發(fā)生過程中基因動態(tài)表達的水平變化，有助于對該過程中重要作用的未知基因的發(fā)現(xiàn)。本實驗研究的目的基因C P E D l 在S S C s 的轉錄組測序中特異高表達并功能未知，因此有可能對S S C s 分化具有重要作用，因此本實驗同時利用基因過表達技術和C R I S P R ／C a s 9技術實現(xiàn)對測序過程中發(fā)現(xiàn)的精原干細

5、胞高表達基因C P E D l 功能的研究，為闡明生殖細胞發(fā)生及分化機制提供高效方法。本研究的主要內(nèi)容如下：( 1 ) 基于本實驗室前期R N A ．S e q 技術發(fā)現(xiàn)C P E D t 在E S C s 向S S C s 分化過程中存在顯著差異表達。通過q P C R 克隆如皋黃雞C P E D l 編碼序列，同時構建過表達載體p c D N A 3 ．0 一C P E D l 和敲除載體C a s 9 ／g R N A 。通過F

6、u g e n e 轉染C a s 9 ／g R N A 載體，利用T 7 E 1 酶切、S S A 活性檢測、T A 克隆測序和脫靶效率檢測C a s 9 ／g R N A 載體敲除活性及脫靶情況。在D F ．1 細胞中通過T 7 E 1 酶切檢測C a s 9 ／g R N A 載體的活性，酶切結果表明，通過條帶灰度值估計C a s 9 ／g R N A l 載體、C a s 9 ／g R N A 2 載體和C a s 9 ／g R