慢性炎癥誘導(dǎo)的肝前體細(xì)胞向肝癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)化及其與索拉菲尼治療的相關(guān)研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　肝癌是具有高度異質(zhì)性的復(fù)雜物，這為肝癌干細(xì)胞的存在提供了理論依據(jù)。早期的證據(jù)已經(jīng)說明了肝癌干細(xì)胞的擴(kuò)增有助于肝癌的發(fā)生。大量的研究證實(shí)腫瘤干細(xì)胞具有很強(qiáng)的腫瘤起始的能力、自我更新的能力、較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力、化療抵抗以及促進(jìn)血管生成的能力。與肝癌干細(xì)胞相比，肝前體細(xì)胞(LPC Hepatic progenitorcell)主要分布在成人的肝臟組織中，具有有限的自我更新能力和較低的分化潛能。肝前體細(xì)胞又叫卵圓細(xì)胞，主

2、要是分布在肝臟的赫林氏管上的正常上皮細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道OV6或者CK19可以作為L(zhǎng)PC特有的標(biāo)志物，LPC具有向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和膽管細(xì)胞雙向分化的能力，當(dāng)發(fā)生組織損傷或者炎癥時(shí)被激活，但只有當(dāng)發(fā)生遷延不愈的炎癥刺激時(shí)才會(huì)產(chǎn)生代償性的擴(kuò)增。大量的研究表明LPC的活化擴(kuò)增可以明顯的促進(jìn)其惡性轉(zhuǎn)變，這可能是由LPC轉(zhuǎn)變成肝癌干細(xì)胞的最直接證據(jù)。然而在慢性炎癥導(dǎo)致肝癌發(fā)生的過程中，LPC是否轉(zhuǎn)變成肝癌干細(xì)胞的現(xiàn)象及機(jī)制并不明確，仍需進(jìn)一步探究。

3、>　　目前肝癌的常規(guī)治療包括肝癌切除術(shù)、肝臟移植、射頻消融和經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞術(shù)等。然而這些常規(guī)的治療方式并不能有效的去除肝癌干細(xì)胞，因此肝癌的復(fù)發(fā)率仍然較高。隨著小分子靶點(diǎn)藥物的研究不斷深入，越來越多的靶點(diǎn)藥物開始應(yīng)用于腫瘤的治療中去。索拉菲尼作為目前唯一被批準(zhǔn)用于晚期肝癌治療的小分子化合物，已經(jīng)廣泛用于晚期肝癌患者的臨床治療。索拉菲尼在體外激酶抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，索拉菲尼可以有效的抑制VEGFR1-3、PDGFRβ、C-kit、B-Raf

4、、 Raf-1和Flt3等靶點(diǎn)分子。近期有文獻(xiàn)報(bào)道索拉菲尼可以通過抑制STAT3的磷酸化從而抑制膽管癌的發(fā)生。
　　為了去探尋慢性炎癥在LPC向肝癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的作用，我們利用大鼠DEN誘癌模型模擬了在肝癌發(fā)生過程中隨著炎癥的加重，LPC的活化擴(kuò)增更加明顯，這一現(xiàn)象到肝硬化階段更為突出。有趣的是清除大鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞后抑制了CK19和OV6雙陽(yáng)性這種可能LPC來源的肝癌發(fā)生。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可以通過調(diào)節(jié)UBD和Ch

5、k2的表達(dá)，從而引起了染色體的不穩(wěn)定性，這可能是肝前體細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變的原因。臨床病理指標(biāo)及預(yù)后信息分析證明CK19和OV6雙陽(yáng)性的肝癌患者預(yù)后更差，并且對(duì)索拉菲尼治療更為敏感。因此我們的結(jié)果不僅闡明了慢性炎癥導(dǎo)致LPC向肝癌干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制，同時(shí)還提出了一種全新的分子分型，為索拉菲尼的臨床應(yīng)用提供了指導(dǎo)。
　　研究方法:
　　1.利用免疫組織熒光共染的方法檢測(cè)人的肝臟組織（正常肝、纖維化/肝硬化、肝癌癌旁）中LPC

6、標(biāo)志物CK19和OV6的表達(dá)情況，觀察在肝癌發(fā)生各個(gè)階段中LPC擴(kuò)增情況。
　　2.給SOX9-CreERT2 DTR-eGFP示蹤小鼠腹腔注射DEN和CCl4試劑，建立DEN+CCl4肝癌發(fā)生模型，對(duì)肝癌組織利用H&E和免疫組化染色檢測(cè)α-SMA和GFP的表達(dá)情況，觀察該小鼠模型在肝癌階段中LPC擴(kuò)增情況。
　　3.給大鼠注射DEN試劑，建立大鼠肝癌發(fā)生模型，通過免疫組化的方法對(duì)大鼠肝癌發(fā)生各個(gè)階段的肝臟組織（正常肝、纖維

7、化/肝硬化、肝癌癌旁）中CK19和OV6的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，觀察在大鼠肝癌發(fā)生各個(gè)階段LPC擴(kuò)增情況。
　　4.對(duì)分選出來的OV6陽(yáng)性的LPC進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)成熟的肝細(xì)胞標(biāo)志物(Ttr、Alb)和膽系標(biāo)志物(CD133、CK19、SOX-9、CD90)的mRNA的表達(dá)情況，觀察OV6陽(yáng)性的LPC是否為前體源性。
　　5.對(duì)原代LPC種植在NOD/SCID小鼠皮下的成瘤組織分別進(jìn)行H&E染色、免疫組化檢測(cè)AFP的表達(dá)和免疫

8、熒光共染檢測(cè)CK19（紅色熒光）和OV6（綠色熒光）的表達(dá)情況，鑒別荷瘤組織是否為L(zhǎng)PC源性的肝癌組織。
　　6.對(duì)大鼠肝硬化階段的組織進(jìn)行H&E染色分析和免疫組化方法檢測(cè)CD68、TNF-α、IL-6的表達(dá)情況，觀察大鼠誘癌肝硬化階段組織的炎癥浸潤(rùn)和炎性因子的表達(dá)。
　　7.通過尾靜脈注射GdCl3的方法建立大鼠巨噬細(xì)胞清除模型，利用免疫組化方法檢測(cè)肝癌組織中CK19和OV6的表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)CK19和OV6雙陽(yáng)性的肝癌比例

9、。
　　8.對(duì)大鼠和小鼠的原代肝細(xì)胞以及肝前體細(xì)胞系(WB、LEPC)進(jìn)行IL-6Rα、IL-6Rβ和TNFR免疫蛋白印跡檢測(cè)，觀察IL-6Rα、IL-6Rβ和TNFR的表達(dá)情況。
　　9.將TNF-α長(zhǎng)期作用的WB細(xì)胞種植于NOD/SCID小鼠皮下，對(duì)其成瘤的組織進(jìn)行H&E染色、免疫組化檢測(cè)AFP的表達(dá)和免疫熒光共染檢測(cè)CK19（紅色熒光）和OV6（綠色熒光）的表達(dá)情況，觀察荷瘤組織是否為L(zhǎng)PC來源的肝癌。
　　10

10、.利用體內(nèi)有限稀釋的方法，觀察TNF-α長(zhǎng)期作用的WB-F344和LEPC細(xì)胞系在NOD/SCID小鼠皮下的成瘤能力。
　　11.利用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)分析TNF-α長(zhǎng)期作用的WB-F344和LEPC細(xì)胞系中CD90和EpCAM的表達(dá)情況，觀察炎癥因子TNF-α長(zhǎng)期作用是否促進(jìn)LPC向肝癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)變。
　　12.對(duì)TNF-α長(zhǎng)期作用的WB-F344和LEPC細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析檢測(cè)，分析WB-F344和LEPC細(xì)胞的染色體數(shù)

11、目，研究TNF-α長(zhǎng)期作用的WB-F344和LEPC細(xì)胞是否發(fā)生了染色體不穩(wěn)定性。
　　13.利用蛋白免疫印跡、RT-PCR和細(xì)胞免疫熒光等技術(shù)檢測(cè)TNF-α長(zhǎng)期作用的WB-F344和LEPC細(xì)胞中DNA損傷、細(xì)胞有絲分裂檢查點(diǎn)和中心體的標(biāo)志物，探究染色體不穩(wěn)定性的機(jī)制。
　　14.利用免疫組化分析技術(shù)，分別檢測(cè)了163例肝癌組織中CK19和OV6的表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)分析CK19和OV6雙陽(yáng)性組和對(duì)照組的臨床病理信息和患者預(yù)后資

12、料，研究CK19和OV6雙陽(yáng)性患者的病理特征和預(yù)后關(guān)系。
　　15.利用蛋白免疫印跡的方法檢測(cè)TNF-α長(zhǎng)期作用的WB和LEPC細(xì)胞中加入索拉菲尼后STAT3磷酸化水平，探究索拉菲尼抑制TNF-α長(zhǎng)期作用的WB和LEPC細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。
　　16.利用細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)和流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)TNF-α長(zhǎng)期作用的WB和LEPC細(xì)胞加入索拉菲尼后的成球數(shù)目和細(xì)胞凋亡比例，探究索拉菲尼對(duì)TNF-α長(zhǎng)期作用的WB和LEPC細(xì)胞功能的影響

13、。
　　17.利用免疫組化分析技術(shù)檢測(cè)203例肝癌術(shù)后服用索拉菲尼和77例術(shù)后未服用索拉菲尼的肝癌患者組織中CK19和OV6的表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)分析各組肝癌患者預(yù)后資料，評(píng)估索拉菲尼對(duì)CK19和OV6雙陽(yáng)性肝癌患者的治療效果。
　　研究結(jié)果:
　　1.在肝癌患者疾病進(jìn)展過程中，隨著病情的進(jìn)展LPC不斷擴(kuò)增，其中肝硬化階段LPC明顯擴(kuò)增。
　　2.利用大鼠DEN誘癌模型模擬人的肝癌發(fā)生，研究發(fā)現(xiàn)大鼠誘癌過程中LPC不斷

14、擴(kuò)增，其中肝硬化階段LPC明顯擴(kuò)增。
　　3.為了研究肝巨噬細(xì)胞對(duì)LPC擴(kuò)增的影響，我們發(fā)現(xiàn)DEN大鼠誘癌過程中，在肝硬化階段巨噬細(xì)胞明顯浸潤(rùn)，炎癥因子分泌增多，說明巨噬細(xì)胞可能促進(jìn)了LPC的擴(kuò)增。
　　4.我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在DEN誘癌模型的肝硬化階段，由慢性炎癥刺激擴(kuò)增的LPC在NOD/SCID的小鼠皮下可以成瘤，說明這個(gè)階段的LPC可能已經(jīng)向肝癌干細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。
　　5.為了進(jìn)一步驗(yàn)證巨噬細(xì)胞在LPC向肝癌干細(xì)胞

15、轉(zhuǎn)化過程中的作用，我們建立了GdCl3清除肝臟巨噬細(xì)胞的大鼠模型，我們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞清除組，CK19和OV6雙陽(yáng)性的肝癌發(fā)生受到抑制。
　　6.我們利用肝巨噬細(xì)胞分泌主要炎癥因子TNF-α和IL-6分別刺激大鼠肝前體細(xì)胞系WB-F344，20w后將其種在NOD/SCID小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)TNF-α長(zhǎng)期刺激的LPC在皮下可以成瘤，這說明了TNF-α可能促進(jìn)LPC發(fā)生轉(zhuǎn)化。
　　7.為了探究TNF-α長(zhǎng)期作用的LPC是否具有肝癌干細(xì)胞

16、的特征，我們檢測(cè)了肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD90和EpCAM，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期刺激組的標(biāo)志物表達(dá)都明顯升高，說明TNF-α長(zhǎng)期作用的LPC獲得了肝癌干細(xì)胞特征。
　　8.為了探究LPC向肝癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的具體機(jī)制，我們對(duì)TNF-α長(zhǎng)期作用的WB和LEPC細(xì)胞系做了染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)TNF-α刺激可以導(dǎo)致LPC染色體數(shù)目發(fā)生改變。
　　9.前期的結(jié)果部分說明了CK19和OV6雙陽(yáng)性的肝癌可能是LPC來源的，我們的臨床分析發(fā)現(xiàn)這部分的肝癌患者

17、預(yù)后更差。
　　10.我們發(fā)現(xiàn)索拉菲尼可以通過抑制STAT3磷酸化抑制LPC來源的肝癌干細(xì)胞生長(zhǎng)。
　　11.臨床分析研究發(fā)現(xiàn)CK19和OV6雙陽(yáng)性的肝癌患者可能對(duì)索拉菲尼治療更敏感。
　　結(jié)論:
　　本課題主要是研究肝臟在慢性炎癥環(huán)境下，LPC可以明顯擴(kuò)增，擴(kuò)增的LPC在炎癥因子的刺激下可以部分轉(zhuǎn)變成為肝癌干細(xì)胞。我們通過研究發(fā)現(xiàn)，CK19和OV6雙陽(yáng)性的肝癌可以部分認(rèn)為是LPC惡性轉(zhuǎn)化而來的腫瘤，臨床分析結(jié)果