肝臟卵圓細(xì)胞在急性膽道梗阻中變化的研究.pdf

1、一、背景和目的：
　　 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人慢性肝病組織如肝硬化、亞大塊肝壞死后肝再生、兒童先天性肝外膽道閉鎖、遺傳性血色病、慢性病毒性肝炎、原發(fā)性肝癌中都存在類似于卵圓細(xì)胞的肝前體細(xì)胞。這種肝前體細(xì)胞定位于匯管區(qū)、纖維間隔、匯管區(qū)旁肝實(shí)質(zhì)、假小葉及炎癥邊界。研究發(fā)現(xiàn)卵圓細(xì)胞存在于肝硬化,肝癌等各種慢性肝病的肝臟組織中,肝臟卵圓細(xì)胞在慢性肝炎肝臟組織中陽(yáng)性表達(dá)。隨著肝臟卵圓細(xì)胞特異性標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn),卵圓細(xì)胞相關(guān)研究成為熱點(diǎn),特別是肝臟卵圓細(xì)

2、胞雙重分化特性及參加肝臟損傷后的修復(fù)的相關(guān)研究,更為研究者探究肝臟損傷的保護(hù)、治療及肝纖維化的形成機(jī)制提供了最新途徑。
　　 在肝膽外科臨床中,膽道梗阻、膽汁淤積是常見的病理環(huán)境,較長(zhǎng)時(shí)間梗阻,可誘發(fā)永久性肝損害,甚至發(fā)展成肝纖維化及肝硬化,是臨床治療的難題,相關(guān)發(fā)病機(jī)制基礎(chǔ)研究有現(xiàn)實(shí)意義。目前肝臟卵圓細(xì)胞與外科急性膽道梗阻后肝組織損傷及修復(fù)的相關(guān)研究,國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。另外,膽道梗阻模型可以結(jié)扎嚙齒類動(dòng)物的膽總管獲得,大鼠的膽總

3、管結(jié)扎模型已有了評(píng)估和描述,為研究提供了可靠的動(dòng)物模型。
　　 本研究通過結(jié)扎Wistar大鼠膽總管動(dòng)物模型,復(fù)制急性膽道梗阻病理狀態(tài),評(píng)估膽總管結(jié)扎模型的可行性并總結(jié)模型建立經(jīng)驗(yàn)；通過組織學(xué)技術(shù),探究肝臟卵圓細(xì)胞與急性膽道梗阻后肝臟病理改變的相關(guān)性。
　　 二、材料與方法：
　　 雄性wistar大鼠90只。體重250-300克,將動(dòng)物隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)通過膽總管接扎,造模成功8只。術(shù)后觀察

4、所有動(dòng)物的體重、活動(dòng)及黃疸情況。術(shù)后第1、2、3、5、7天,每組各處死8只,取血行總膽紅素(TBIL)、直膽紅素(DBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)檢查。取肝右葉應(yīng)用4％多聚甲醛固定,行肝臟組織學(xué)分析。
　　 1、通過觀察不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重、黃疸及活動(dòng)變化情況,采集不同時(shí)間點(diǎn)血液標(biāo)本,進(jìn)行酶學(xué)檢測(cè),總結(jié)模型死亡率和成功率。
　　 2、繪制不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重、酶學(xué)指標(biāo)變化曲線,總結(jié)其與病情、病

5、程之間的相關(guān)性。
　　 3、通過肉眼及HE染色觀察急性膽道梗阻不同時(shí)間點(diǎn)肝臟形態(tài)改變。
　　 4、通過膠原特殊染色,觀察肝臟膠原增生情況。
　　 5、通過免疫組化,OV-6標(biāo)汜卵圓細(xì)胞,觀察不同時(shí)間點(diǎn)卵圓細(xì)胞的數(shù)目、分布,探究其與急性膽道梗阻的關(guān)系及變化規(guī)律。
　　 三、結(jié)果：
　　 預(yù)實(shí)驗(yàn)中未分離膽管及結(jié)扎膽管位置過高,出現(xiàn)動(dòng)物死亡和模型成功率僅40％。改進(jìn)后實(shí)驗(yàn)組造模成功率達(dá)90％。實(shí)驗(yàn)組大鼠

6、術(shù)后第1天有體重顯著減輕,但此后體重穩(wěn)定升高,但體重均低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。術(shù)后2天內(nèi)活動(dòng)顯著減少,第3天后基本恢復(fù)正常,而假手術(shù)動(dòng)物活力無明顯變化。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物自第1天出現(xiàn)黃疸,于術(shù)后第3天黃疸加重。對(duì)照組有一只出現(xiàn)黃疸,從組中剔除。膽總管結(jié)扎(bileductligation,BDL)后TBIL和DBIL兩組有顯著差異(P<0.001)。ALT迅速增加,高峰在術(shù)后第1～2天,第3天后迅速下降。ALP術(shù)后第2天達(dá)到高峰,第3天后穩(wěn)步增加。

7、r>　　 急性膽道梗阻后,肝組織學(xué)檢查顯示:梗阻時(shí)間延長(zhǎng),肝細(xì)胞發(fā)生變性壞死程度加重,伴有大量以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),從膽管梗阻處逐漸轉(zhuǎn)向肝門。膠原染色特異性顯示膠原纖維為紅色,顯微鏡下觀察膠原纖維分布與含量?jī)山M術(shù)后第1及2天無明顯差異,而術(shù)后第3、5、7天兩組的膠原含量及分布范圍有明顯差異。實(shí)驗(yàn)組肝臟膠原纖維梗阻時(shí)間延長(zhǎng)則增生明顯。
　　 OV-6免疫組化陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)目及分布范圍隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,實(shí)驗(yàn)組和

8、對(duì)照組有明顯差異。(P<0.05)。
　　 四、結(jié)論：
　　 1、按照本實(shí)驗(yàn)描述的模型建立方法,簡(jiǎn)單易行、重復(fù)性及穩(wěn)定性好,可以得到滿意急性膽道梗阻模型。造模成功率與分離膽管的精確度、結(jié)扎位置、力度、膽管側(cè)枝存在及動(dòng)物個(gè)體差異性相關(guān)。
　　 2、急性膽道梗阻后肝臟細(xì)胞損傷逐漸加重,膽道梗阻后第3天,是肝臟細(xì)胞急性損傷反應(yīng)最強(qiáng)烈的時(shí)間點(diǎn),之后機(jī)體開始進(jìn)入自我調(diào)節(jié)及修復(fù)過程。膽道梗阻后7天,激活了具有分化能力的儲(chǔ)備細(xì)