不同急性肝損傷模型大鼠卵圓細胞生物學差異及自噬的變化.pdf

1、多種原因均可引起急性肝損傷的發(fā)生，急性肝損傷后的高死亡率和預后差一直是醫(yī)學界的難題。目前如何更好地治療肝損傷仍是國內外的一個難點。嚴重的急性肝功能損傷常引起急性肝功能衰竭，致肝功能不可逆轉而危及生命。終末期肝病目前最好的治療方法為原位肝移植，但供體有限及術后免疫排斥反應是兩個主要的障礙。
　　 卵圓細胞作為肝臟的干細胞，在肝損傷的修復中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，卵圓細胞不同時間點其增殖率不同，于此提出卵圓細胞在各時間點增殖動力存在

2、差異，EpCAM和PCNA共表達反應卵圓細胞增殖活性，即各時間點EpCAM和PCNA共表達存在差異。卵圓細胞具有多向分化功能，其可分化為肝細胞、膽管細胞及肝癌細胞，甚至胰島細胞等，而在對卵圓細胞標記物的研究中發(fā)現(xiàn)膽管細胞表達CK19，肝母細胞表達AFP，可進行卵圓細胞分化方向的判斷。判斷卵圓細胞的分化研究有助于對肝臟疾病治療進行評估。
　　 近年，自噬與凋亡的研究是熱點問題。自噬是一個必不可少的，保守的通過消除蛋白質聚集和破壞細

3、胞器來控制胞漿性質的溶酶體降解過程。自噬與凋亡存在密切關系，兩者相互協(xié)同而對細胞轉歸產生影響。而自噬與凋亡的確切關系仍存在爭議。卵圓細胞作為肝臟干細胞，參與肝臟的再生性修復及疾病演變，卵圓細胞是否存在自噬現(xiàn)象與其分化與增殖有無關聯(lián)？本實驗建立了不同的急性肝損傷模型，對卵圓細胞在不同情況下增殖及分化有無差異，并對肝損傷修復中自噬及凋亡進行了初步研究。
　　 目的:建立不同的肝卵圓細胞增殖模型，觀察其增殖、分化的差異及自噬的變化情況

4、。
　　 方法:①選擇健康SD大鼠隨機分為五組，分別為四氯化碳組、D-gal組、假手術組、2-AAF/PH組及空白對照組，建立肝損傷模型。分別于1d、7d、14d、21d處死動物取肝臟組織。②采用hematoxylin&eosinstaining(H&E染色)觀察大鼠肝組織病理組織學表現(xiàn)。③免疫熒光技術觀察不同時間點卵圓細胞表達，對陽性細胞進行定量技術分析。④免疫熒光雙標方法觀察卵圓細胞增殖動力變化。⑤免疫組織化學方法觀察卵圓細

5、胞分化標記物AFP、CK-19、C-kit的表達，并對其進行定量技術分析判斷其表達有無差異。⑥電鏡下觀察卵圓細胞自噬體超微結構。⑦WesternBlotting技術觀察自噬標記蛋白LC3-Ⅱ蛋白及Beclin-1蛋白表達。⑧原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測凋亡有無變化。
　　 結果:①與空白對照組相比，應用四氯化碳組大鼠肝臟顏色為暗紅色，質脆，約14天后漸恢復正常;D-gal組大鼠肝臟水腫明顯，色暗紅，質脆，約14天后漸恢復

6、正常;假手術組大鼠肝臟與之相比未見明顯差異;2-AAF/PH組與之相比，1天肝臟呈淡紅色，質脆，約21天后肝臟大小及顏色恢復正常。②肝臟組織H&E結果顯示，與空白對照組相比，四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組可見肝細胞腫脹，排列紊亂，于匯管區(qū)周圍可見細胞形態(tài)小于肝細胞，核質深染，細胞核呈卵圓形的卵圓細胞;四氯化碳組和D-gal組炎癥細胞浸潤明顯比2-AAF/PH組少，卵圓細胞少。③血清肝功能檢測顯示，大鼠造模完成后第1天肝功能

7、同空白對照組相比，假手術組肝功能變化無明顯差異。四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組大鼠天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartateaminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉移酶（alanineaminotransferase，ALT）及堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)水平明顯升高（AST:133.97±14.35U/Lvs82.47±21.86U/L,P＜0.05;346.17±9.75U

8、/Lvs82.47±21.86U/L，P＜0.05;557.97±12.85U/Lvs82.47±21.86U/L，P＜0.05;ALT:47±9.35U/Lvs41.97±6.64U/L，P＜0.05;102.44±5.04U/Lvs41.97±6.64U/L，P＜0.05;249.1±19.71U/Lvs41.97±6.64U/L,P＜0.05;ALP:270.33±36.09Uvs53.27±8.50U，P＜0.05;379.33

9、±21.55Uvs53.27±8.50U,P＜0.05;520.67±33.02Uvs53.27±8.50U,P＜0.05;），白蛋白(albumin，ALB)水平明顯下降（23.37±2.21g/Lvs32.13±3.73g/L，P＜0.05;22.9±2.50g/Lvs32.13±3.73g/L，P＜0.05;23.9±1.06g/Lvs32.13±3.73g/L，P＜0.05）。四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組之間比較

10、，2-AAF/PH組肝功能變化較大。④免疫熒光檢測小鼠抗大鼠OV6抗體表達顯示:四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組對OV6抗體表達均在1～14天表達呈上升趨勢，14～21天呈下降趨勢，14天表達量最高。假手術組與空白對照組比較表達無明顯規(guī)律性。四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組與空白對照組相比OV6抗體的表達在術后1天、7天、14天及21天均明顯增高，尤以14天升高最明顯(109.67±4.04vs5.67±1.53

11、，P＜0.05;154.67±8.02vs5.67±1.53，P＜0.05;292.67±8.50vs5.67±1.53，P＜0.05)，假手術組表達無明顯變化(2.67±0.58vs5.67±1.53，P＞0.05)。四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組之間相比，2-AAF/PH組對OV6抗體的表達明顯增高。⑤EpCAM和PCNA熒光雙標檢測反映卵圓細胞增殖動力:四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組卵圓細胞增殖率在術后

12、1天、7天、14天及21天呈下降趨勢，并在術后7～14天下降明顯，2-AAF/PH組在7天時為（82.8±2.60）％，在14天則下降至(51.90±2.01)％，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。假手術組與空白對照組比較無明顯差異。⑥免疫組織化學染色顯示:與空白對照組相比，四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組對AFP、CK19及C-kit的表達均增加，且為1～14天呈上升趨勢，14天達高峰值，14～21天呈下降趨勢（AFP、CK19及

13、C-kit四氯化碳組:116.67±3.51vs4.33±2.31，P＜0.05;108.67±6.51vs2.67±0.89,P＜0.05;105.33±4.16vs4.00±1.00，P＜0.05;D-gal組:155.33±5.69vs4.33±2.31,P＜0.05;148.67±6.03vs2.67±0.89,P＜0.05;157.67±3.22vs7.67±2.08，P＜0.05;2-AAF/PH組:265.33±8.08v

14、s4.33±2.31，P＜0.05;261.0±18.68vs2.67±0.89，P＜0.05;236.33±6.51vs4.00±1.00,P＜0.05）。假手術組與空白對照組比較無明顯變化（4.67±1.15vs4.33±2.31，P＞0.05;3.00±1.00vs2.67±0.89,P＞0.05;3.67±0.58vs4.00±1.00,P＞0.05）。四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組對AFP的表達存在差異（F值為2

15、60.421，P＜0.01）;對CK19的表達有差異（F值為144.632，P＜0.05）;對C-kit的表達有差異（F值為273.875，P＜0.05），表現(xiàn)為2-AAF/PH組對AFP、CK19及C-kit的表達高于其余各組。⑦透射電鏡顯示1天、7天、14天及21天卵圓細胞內均未發(fā)現(xiàn)自噬體。1天時電鏡下觀察卵圓細胞體積小，胞核與胞漿比值較高，細胞器組成為散在明顯的微絲束和較多的核糖體及少許粗面內質網(wǎng)，7天到21天觀察卵圓細胞體積多較

16、1天時大，此時含有較多的粗面內質網(wǎng)及糖元，也可見少量的張力微絲。⑧Westernblot檢測結果顯示:四氯化碳組、D-gal組及2-AAF/PH組大鼠肝臟組織中Beclin-1及LC3-Ⅱ蛋白隨時間變化表達水平明顯增加，各組間對Beclin-1蛋白的表達存在差異（F值為7.811，P＜0.05），各組間對LC3-Ⅱ蛋白的表達亦存在差異（F值為27.592，P＜0.05）。假手術組與空白對照組大鼠肝組織Beclin-1及LC3-Ⅱ蛋白表達

17、水平與時間變化無明顯變化(Beclin-1:F值為0.413，P＞0.05;LC3-Ⅱ:F值為1.173，P＞0.05)。⑨TUNEL檢測結果顯示:2-AAF/PH組凋亡細胞表達在1～14天呈上升趨勢，14～21天凋亡細胞表達呈下降趨勢。
　　 結論:不同模型的急性肝損傷肝臟的損傷程度不同，以2-AAF/PH組為重，四氯化碳組和D-gal組次之。2-AAF/PH組肝臟的修復通過肝卵圓細胞的活化來完成。四氯化碳組和D-gal組作為