大鼠膽道梗阻及再通術后肝臟中PERK表達變化與中藥的作用影響.pdf

1、實驗目的：
　　本研究通過建立SD大鼠梗阻性黃疸模型及膽道梗阻再通模型，探討膽道梗阻后大鼠肝組織中PERK的表達變化，以及梗阻性黃疸再通術后PERK表達變化與中藥茵陳蒿湯對肝臟的保護作用，為圍手術期清熱利濕中藥在臨床上的合理應用提供理論基礎。
　　實驗方法：
　　選擇128只成年雄性SD大鼠，體重(270-300)g，動物級別為清潔級，隨機分為四組：①梗阻性黃疸組(O組)32只；②假手術對照組(S組)32只；③梗阻性黃

2、疸再通模型+中藥灌胃組組(ORC)32只；④梗阻性黃疸再通模型+生理鹽水灌胃組(ORW組)32只。S組僅行手術探查、分離膽管，但不予膽管結扎，O組先行手術探查、分離膽管，然后采用雙重線結扎法建立梗阻性黃疸模型，兩組均于術后1d、3d、5d、7d[1]，每個時相點處死大鼠8只；ORW組、ORC組借鑒本課題之前造模方法建立膽汁體外引流模型[2]行體外膽道梗阻，并于梗阻后第7天解除梗阻，ORW組、ORC組均于梗阻解除后1d、3d、5d、7d每

3、個時相點處死大鼠8只。留取血液標本：檢測比較各組動物血清中谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)指標含量；留取少量肝臟組織標本置于-80℃冰箱保存，應用蛋白質(zhì)印跡法(western blot)測定肝組織中PERK蛋白表達變化，應用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測大鼠肝組織PERK基因表達情況；剩余肝組織固定于5％中性福爾馬林溶液中，應用免疫組化檢測肝組織中PERK蛋白的表達情況

4、，應用HE染色法觀察肝組織細胞水平的病理變化。
　　實驗結果：
　　1.生化指標：S組：術后第1天時AST、ALT少量升高，但是都處于正常范圍，差異無統(tǒng)計學意義；以S組為對照組，O組術后第1天AST、ALT迅速增高，提示膽總管雙重結扎法致梗阻性黃疸大鼠模型造模成功；其中AST、ALT均于術后第1天達到峰值，然后開始下降，自第5天起維持在較高水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。ORW組及ORC組解除梗阻后AST、ALT均呈

5、下降趨勢；以ORW組為對照，ORC組AST水平在給完中藥后第3、5天數(shù)值均低于ORW組，下降趨勢表現(xiàn)更加明顯(P<0.05)，直至兩組恢復大致正常水平；ORC組的ALT水平在第1、3天數(shù)值均低于ORW組，下降趨勢也更加明顯(P<0.05)，直至兩組恢復大致正常水平。S組術后TBIL、DBIL均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義；與S組比較，O組梗阻后TBIL、DBIL均呈增高趨勢，并于第5、7天后趨于穩(wěn)定(P<0.05)。ORW組及ORC組自

6、解除梗阻后TBIL、DBIL均呈下降趨勢；以ORW組為對照組，ORC組的下降趨勢更加明顯(P<0.05)。
　　2.肝組織病理：S組肝細胞形態(tài)正常，細胞索排列整齊，未見炎性細胞浸潤，顯示正常肝小葉結構；O組膽管結扎后第1天可見匯管區(qū)、肝血竇內(nèi)有淤膽現(xiàn)象，伴少量炎細胞浸潤，第3天可以發(fā)現(xiàn)細小膽管增生，第7天可見肝細胞的壞死灶。解除梗阻后，ORC組及ORW組自第3天起，肝細胞變性壞死灶減少，肝組織內(nèi)炎性細胞含量逐漸減少，纖維組織細胞增

7、生減輕；ORC組肝細胞在病理學改變優(yōu)于ORW組。
　　3.采用western blot檢測肝組織中PERK：在蛋白表達水平上，以 GAPDH為內(nèi)參，S組術后PERK表達不明顯，差異無統(tǒng)計學意義；以S組為對照組，O組PERK的表達量緩慢升高，各時相點均出現(xiàn)明顯差異(P<0.05)。解除梗阻后， ORC組及ORW組PERK蛋白的表達量整體上均呈下降趨勢(P<0.05)，并于第7天時達到最低點；以ORW組為對照組，ORC組PERK的表達

8、量與之比較，各時相點均出現(xiàn)明顯差異(P<0.05)，ORC組PERK表達水平低于ORW組。
　　4.免疫組化檢測肝組織PERK的表達：鏡下可見S組大鼠肝臟內(nèi)表達較少的PERK。與S組相比，隨著造模時間的延長，O組PERK陽性表達量逐漸增加(P<0.05)，主要在細胞核表達，細胞漿少量表達。梗阻解除后，ORW組及ORC組PERK蛋白的表達水平整體上均有下降，并于第7天時達到最低；以ORW組為對照組，ORC組PERK的表達量各時相點均

9、低于ORW組(P<0.05)。
　　5、R-T PCR檢測大鼠肝細胞中PERK基因：S組PERK mRNA表達水平隨造模時間加長無明顯變化，一直處于低位水平，差異無統(tǒng)計學意義。O組PERK mRNA表達水平隨造模時間加長升高；以S組為對照組，O組PERK mRNA表達水平在各個時相點均高于S組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。解除梗阻后， ORC組及ORW組PERK mRNA的表達水平整體上均呈現(xiàn)下降趨勢，并于第7天時達到最低點

10、；以ORW組為對照組，ORC組PERK mRNA的表達水平在各時相點均表現(xiàn)明顯差異(P<0.05)，ORC組PERK mRNA表達水平低于ORW組。
　　結論：
　　1.當梗阻性黃疸時，隨著造模時間的延長，PERK及PERK mRNA表達水平呈逐漸增加趨勢，且 PERK的表達水平的變化與梗阻性黃疸及膽道再通術后黃疸程度的高低有顯著的相關性，這表明在梗阻性黃疸大鼠模型中，存在PERK介導的ERS和細胞凋亡，且凋亡指數(shù)與黃疸水平

11、的高低顯著相關。
　　2.梗阻性黃疸大鼠模型解除梗阻后給予中藥茵陳蒿湯可以調(diào)節(jié)PERK mRNA的表達，進而減少因PERK高度表達引起的肝細胞損傷，改善肝臟因梗阻引起的肝功能異常。梗阻性黃疸時肝損傷程度與 PERK基因表達水平具有相關性，表明梗阻性黃疸時PERK參與了ERS介導的肝細胞凋亡。
　　3．針對臨床上梗阻性黃疸患者的圍手術期治療，合理的手術方式結合辯證的選取清熱利濕中藥（茵陳蒿湯）作為輔助療法，可以更好的降低相關并