胰島素抵抗大鼠肝臟組織PERK和ρ-PERK的表達及意義.pdf

1、糖尿病(DM)是嚴重危害人類健康的常見病,目前全世界有1億7千萬DM患者,預計在未來25年內(nèi)DM患者將達到3億6千萬。臨床上DM主要分為1型糖尿病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM),而T2DM占DM的90％～95％。T2DM是以骨骼肌、肝臟及脂肪等胰島素靶組織胰島素抵抗為主要特征。T2DM的發(fā)病機制目前尚不完全清楚,近年研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,Erstress)在肥胖所致胰島素抵

2、抗中占重要地位,與靶組織胰島素抵抗和胰島B細胞功能障礙密切相關;因此ER應激在肥胖導致的胰島素抵抗中的作用已成為當前糖尿病研究的熱點領域。
　　 內(nèi)質網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是細胞內(nèi)重要的細胞器,是調節(jié)蛋白質合成及合成后折疊及聚集的場所,是調節(jié)細胞的應激反應及細胞鈣水平的場所,也是膽固醇和類固醇及許多脂質合成的場所。在缺氧、氧化應激、異常糖基化反應以及鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡等各種因素作用下,新生肽鏈的修飾折

3、疊與組裝受到干擾,將引起未折疊蛋白在ER中堆積,使細胞產(chǎn)生內(nèi)質網(wǎng)應激(ERS),并激活未折疊蛋白反應(UPR)信號轉導通路,導致細胞自身通過改變其轉錄和翻譯過程,減少蛋白的合成,降低進入內(nèi)質網(wǎng)的蛋白量,同時上調內(nèi)質網(wǎng)中分子伴侶和折疊蛋白的表達,增強內(nèi)質網(wǎng)的蛋白折疊功能。細胞還可以通過上調內(nèi)質網(wǎng)蛋白降解途徑的相關基因表達,加速未折疊蛋白的降解過程,以提高細胞在有害因素下的生存能力。ERS是在應激條件下,為維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,保持細胞生存,

4、細胞啟動的自我保護反應機制。
　　 研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過16周高脂飲食的小鼠和正常飲食小鼠相比,脂肪組織中ERs的標志,如PREK磷酸化和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)活性均明顯增加,ob/ob小鼠和野生型小鼠相比,脂肪組織中磷酸化的PERK和IRE-1α明顯增高,并且JNK活性和XBP-1的剪接也明顯增加,這些均提示肥胖可以導致脂肪細胞ERs。但肥胖的脂肪組織中發(fā)生Ers的原因目前仍

5、不清楚。但有以下幾種假說:①在營養(yǎng)過剩的情況下,內(nèi)質網(wǎng)中蛋白質合成明顯增加,誘發(fā)UPR;②過剩的營養(yǎng)物質可以作為誘導ERs的信號,在肥胖狀態(tài)下,血漿游離脂肪酸(FFA)水平明顯升高,研究發(fā)現(xiàn),在肝細胞和胰島B細胞中,FFA可以誘導UPR,但是在脂肪細胞中,FFA對內(nèi)質網(wǎng)功能的影響目前還不清楚,在3T3-L1脂肪細胞中,FFA可以激活JNK,導致IR。而UPR同樣可以激活JNK,所以FFA可能和ERs存在聯(lián)系;③肥胖時發(fā)生ERs的一個原因

6、是葡萄糖缺乏狀態(tài),這在許多細胞,包括脂肪細胞中都被認為是ERs的誘因。在肥胖的脂肪細胞中,因為細胞內(nèi)IR,胰島素信號通路受到抑制,糖份攝取減少,細胞在葡萄糖缺乏或不穩(wěn)定的情況下,容易發(fā)生應激。Hosogai等。發(fā)現(xiàn),肥胖小鼠的脂肪組織和野生型小鼠相比,會出現(xiàn)明顯的低氧征象,在培養(yǎng)的脂肪細胞中,低氧會誘導UPR,表現(xiàn)為Bip等表達增加,eIF2α磷酸化和XBP-1剪接增加。以上多種因素共同作用,相互調節(jié),導致肥胖的脂肪細胞發(fā)生ERs。

7、r>　　 為了應對和適應ERS細胞需要一條由ER到核內(nèi)的信號轉導途徑來提高ER蛋白折疊能力,這條途徑就是非折疊蛋白反應(UPR)。UPR主要包括3條信號通路。分別由3種類型的ER駐留蛋白起始:1型ER轉膜蛋白激酶(type-1ER transmembraneprotein kiIlase IREl)、雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣ER激酶(PKR like ER kinasePERK)和活化轉錄因6(activating transcri

8、ption factor6 ATF6)。另外。近來報道也從不同的細胞中分離得到了其他類型的信號感受器和通路。UPR不僅增加了ER膜的數(shù)量還增加了與蛋白折疊相關的分子伴侶和蛋白修飾酶的數(shù)量。同時還通過阻止蛋白翻譯減少了去往ER的蛋白量。最后.未折疊多肽返回胞質并通過蛋白酶體依賴的途徑降解.這個過程稱為ER相關降解(ER-Associated degradation ERAD)。但是,如果最終ER的正常功能沒有恢復.例如長時間劇烈的UPR可

9、能導致細胞走向凋亡。因此,一旦沒有正確折疊而失去功能的蛋白出現(xiàn)在細胞表面,這個細胞就可能很快被組織清除.
　　 近年來的研究發(fā)現(xiàn),ERS與胰島B細胞的生存、凋亡及糖尿病的發(fā)生密切相關,而對糖尿病過高ERS狀態(tài)進行適當干預,則可能成為糖尿病治療的新手段。目前,雖然ERS參與糖尿病的研究已漸成熱點,但有關ERS介導胰島B細胞功能受損及胰島素抵抗的確切機制,ERS在不同類型糖尿病起病以及糖尿病并發(fā)癥中所扮演的角色,內(nèi)質網(wǎng)分子伴侶在糖尿

10、病治療中的應用,ERS與糖尿病并發(fā)癥共同通路氧化應激間的關系等,還需進一步闡明。
　　 材料與方法:
　　 SPF級4周齡雄性Wistar大鼠30只,體質量80～120g,購自中國醫(yī)科大學實驗動物中心。大鼠適應性喂養(yǎng)1周后,隨機分為正常飲食組(NC組,n=15)和高脂飲食組(HF組,n=15)。NC組給予基礎飼料喂養(yǎng),作為對照組。HF組給予高脂飼料喂養(yǎng),建立胰島素抵抗大鼠模型。10周后,每組隨機抽取5只行高血漿胰島素-正

11、常血糖鉗央以評估胰島素抵抗大鼠模型建立。
　　 左頸總動脈接肝素生理鹽水注射器,右股靜脈接三通管后分別接裝有40mU/mL的人胰島素注射液(丹麥諾和諾德公司產(chǎn)品)和10％葡萄糖注射液的50 mL注射器,再接微量輸液泵。靜置30 min后,頸總動脈取血1 mL測基礎血糖和基礎胰島素。首先輸注胰島素,輸注率1.67 mU·kg-1·min-1),每5min頸動脈取血1滴測血糖,當血糖＞(基礎值±0.5)mmol/L時開始輸注葡萄糖,

12、輸注率從4～6 mg·kg-1·min-1開始。每5min測血糖一次,調整葡萄糖輸注率,使血糖保持在(基礎值±0.5)mmol/L,連續(xù)3次血糖都在上述范圍內(nèi),鉗夾形成。實驗共計約2 h,計算60～120 min的平均GIR,評價胰島素的敏感性。頸動脈血樣4℃,3000×g,離心15 min,分離血清置-80℃冰箱凍存。
　　 NC組和HF組未做鉗夾的20只大鼠禁食16 h,經(jīng)10％水合氯醛(0.3mg/kg)腹腔內(nèi)麻醉后,腹主

13、動脈穿刺取血約4 mL,4℃,3000×g,離心15 min后,分離血清置-80℃冰箱凍存。肝臟組織剪成約100 mg大小的組織塊,剔除血管和其他結締組織,清洗后蘸干,放入1.5ml EP管中于-80℃冰箱中凍存。
　　 取肝臟組織100 mg,加入1 ml蛋白裂解液,超聲勻漿靜置30 min后,4℃,12000×g,離心30 min,取上清,BCA法蛋白定量。取含總蛋白30μg的樣品進行SDS-PAGE電泳,濕轉法將蛋白條帶轉

14、移到PVDF膜上,用含5％脫脂奶粉的TBST封閉1 h后依次加入一抗(兔抗大鼠PERK單克隆抗體,1:500稀釋)、二抗(辣根過氧化酶標記的山羊抗兔單克隆抗體,1:5000稀釋),洗膜后用增強化學發(fā)光法顯像,用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結果。檢測p-PERK蛋白水平時一抗為兔抗大鼠p-PERK單克隆抗體(1:1000稀釋),二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔多克隆抗體(1:5000稀釋)。
　　 取100μL凍存的血清,應用大鼠胰島素

15、ELISA試劑盒(R&D公司),依據(jù)說明書進行操作,檢測基礎狀態(tài)下的血清胰島素水平。
　　 結果:
　　 與NC組相比,HF組60～120 min的平均葡萄糖輸注率(GIR60-120)明顯低于NC組(0.90±0.15mg·kg-1·min-1 vs4.97±0.68 mg·kg-1·min-1,P＜0.01)。與NC組相比,HF組大鼠肝臟p-PERK表達明顯升高(192.89±25.16 vs63.04±15.61,

16、P＜0.05),p-PERK/PERK也明顯升高(0.99±0.12 vs0.33±0.08,P＜0.05)
　　 討論
　　 本研究結果顯示HF組大鼠基礎胰島素水平高于NC組(P＜0.05)并且HF組大鼠GIR60-120顯著低于NC組(P＜0.01),證實IR大鼠模型成功建立;肝臟組織PERK和p-PERK蛋白的表達上,HF組大鼠肝臟組織PERK的表達水平與NC組相比無明顯差異(P＞0.05),而p-PERK表達顯著

17、升高(P＜0.05)。并且HF組大鼠肝臟組織p-PERK/PERK的比值也顯著升高(P＜0.05)。證實在高脂飲食誘導的IR大鼠模型中存在ERS。在本研究中PERK的表達兩組沒有顯著差異可能是因為PERK在生理狀態(tài)下也表達。ERS時一部分PERK通過磷酸化而活化,從而激活其下游的通路。本研究高脂飼料配方中新鮮豬油的主要成分是飽和脂肪酸,10周高脂飼料喂養(yǎng)后,與NC組相比,HF組大鼠體重和基礎血糖無明顯差異(P＞0.05),而血清TG水平

18、顯著升高(P＜0.01),HF組大鼠肝臟組織p-PERK蛋白的表達水平也明顯升高(P＜0.05),并且基礎胰島素水平也顯著升高(P＜0.05)。這些結果表明高脂喂養(yǎng)可能通過脂毒性造成肝臟組織ERS,從而引起IR。營養(yǎng)信號和ERS可以激活PERK,活化的PERK通過激活重要的炎癥激酶c-Jun氨基端激酶(JNK)而調節(jié)胰島素的活性。PERK也可以直接作用于胰島素受體底物(IRS)而改變胰島素的活性。
　　 結論:;