胰島素抵抗大鼠骨骼肌線粒體的功能研究.pdf

1、目的:研究胰島素抵抗(insulin resistance,IR)狀態(tài)下骨骼肌線粒體的功能。在高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗評價胰島素敏感性的基礎(chǔ)上提取骨骼肌線粒體,進行呼吸功能測定和脂肪酸p.氧化狀態(tài)測定,以此來評價骨骼肌線粒體功能失常與IR是否存在密切關(guān)系。
　　 方法:
　　 1.建立IR、1型糖尿病(type1 diabetes mellitus,T1DM)、2型糖尿病(type2 diabetes mellitus,

2、T2DM)3種大鼠模型,同時設(shè)立正常對照(normal control,NC)組。將健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只隨機分為NC組10只、IR組10只、T1DM組15只、T2DM組15只。其中NC組和T1DM組大鼠予普通飼料喂養(yǎng),IR組和T2DM組大鼠飼以高糖高脂飼料。喂養(yǎng)8周后對T1DM組大鼠腹腔注射60mg/kg的鏈脲佐菌素,NC組大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液;對T2DM組大鼠腹腔注射30mg/kg的鏈脲佐

3、菌素建立模型,IR組大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。
　　 2.模型建立成功后對4組大鼠行高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗,以鉗夾過程中60分鐘至120分鐘的平均葡萄糖輸注率(glucose infusionrate,GIR)來反映各組大鼠胰島素的敏感性。
　　 3.取大鼠比目魚肌約1g,進行線粒體的分離、純化,所有操作嚴格在4℃狀態(tài)下進行。采用Clark氧電極法對所提取的新鮮線粒體進行呼吸功能測定,測得線粒體Ⅲ態(tài)呼吸速率與Ⅳ

4、態(tài)呼吸速率,二者之比即為線粒體呼吸控制率(respiratory control rate,RCR)。
　　 4.測定線粒體脂肪酸β-氧化狀態(tài),一方面通過蛋白質(zhì)免疫印跡法(western blot)檢測線粒體肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ(carnitine palmitoyltransferase-Ⅰ,CPT-Ⅰ)的蛋白表達,另一方面應(yīng)用14C標記的同位素方法測定CPT-Ⅰ酶活性。
　　 結(jié)果:
　　 1.喂養(yǎng)8周后4組大

5、鼠體重(kg)分別為NC組0.38±0.08,IR組0.56±0.04,T1DM組0.44±0.03,T2DM組0.52±0.05,其中IR組和T2DM組大鼠體重較NC組和TIDM組均明顯增加(P＜0.05)。4組大鼠成模后空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)(mmol/L)分別為NC組4.03±0.93,IR組4.49±0.71,T1DM組20.90±5.15,T2DM組13.36±4.56,其中T1DM組和

6、T2DM組FBG達到成模標準且較NC組和IR組均明顯升高(P＜0.05)。
　　 2.4組大鼠GIR(mg.kg-1.min-1)分別為NC組12.12±2.70,IR組5.09±0.94,T1DM組12.85±2.43,T2DM組5.99±1.79。其中除NC組與T1DM組、IR組與T2DM組大鼠GIR差異無統(tǒng)計學(xué)意義外,其余任2組間GIR差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),IR組的GIR明顯低于NC組和T1DM組,T2DM

7、組的GIR明顯低于NC組和T1DM組。
　　 3.4組大鼠骨骼肌線粒體RCR分別為NC組4.11±0.30,IR組3.28±0.25,T1DM組3.81±1.17,T2DM組3.49±0.27。IR組和T2DM組的RCR明顯低于NC組(P＜0.05),IR組的RCR明顯低于T1DM組(P＜0.05)。
　　 4.Western blot方法檢測骨骼肌線粒體的CPT-Ⅰ蛋白表達,經(jīng)軟件掃描定量各蛋白條帶的相對灰度比值分別為

8、NC組0.43±0.19,IR組0.18±0.05,T1DM組0.24±0.02,T2DM組0.22±0.17。IR組和T2DM組CPT-Ⅰ蛋白的表達均低于NC組(P＜0.05)。4組間骨骼肌線粒體CPT-Ⅰ酶活性無明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.IR狀態(tài)下骨骼肌線粒體呼吸功能受損,CPT-Ⅰ蛋白表達降低,骨骼肌線粒體功能失常與IR存在密切關(guān)系。
　　 2.高糖狀態(tài)下骨骼肌線粒體呼吸功能以及脂