胃旁路手術(shù)調(diào)控ghrelin表達(dá)改善Goto-Kakizaki大鼠骨骼肌胰島素抵抗的機(jī)制研究.pdf

1、前言:
　　 2型糖尿病(Type2diabetesmellitus,T2DM)是由環(huán)境、基因及內(nèi)分泌因素引起的一種病理狀態(tài),其發(fā)病機(jī)理為胰島β細(xì)胞分泌胰島素功能障礙及外周胰島素抵抗。全球糖尿病人口將在2030年增加50%(既2.85億到4.39億),2010年公布的中國(guó)糖尿病大規(guī)模流行病學(xué)研究顯示,我國(guó)20歲以上人群的糖尿病患病率達(dá)9.7%,推算病人約為9200萬(wàn)人;糖尿病前期患病率達(dá)15.5%,推算處于糖尿病前期者約1.48

2、億人。根據(jù)這項(xiàng)調(diào)查結(jié)果,我國(guó)已成為糖尿病發(fā)病率最高的國(guó)家。對(duì)于。T2DM的臨床治療一直采用傳統(tǒng)的保守治療,包括生活方式的改變及藥物治療。盡管近些年來(lái),藥物治療取得了重大進(jìn)展,然而,藥物治療并不能延緩T2DM患者并發(fā)癥的出現(xiàn)及改善預(yù)后。因此,探求T2DM的有效治療方案是亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。
　　 1980年,美國(guó)減肥外科醫(yī)生WalterPories進(jìn)行減肥手術(shù)時(shí)偶然發(fā)現(xiàn):接受胃旁路手術(shù)(Roux-en-Ygastricbypass

3、,RYGB)的合并T2DM的肥胖病人,術(shù)后血糖降至正常,并且在不用藥物治療的情況下,仍能長(zhǎng)期維持血糖正常,隨后大量臨床報(bào)道都支持此觀點(diǎn)。因?yàn)樵谛g(shù)后體重明顯下降之前,數(shù)天內(nèi)血糖即降至正常范圍,提示血糖的控制是胃旁路手術(shù)本身的作用,而非完全體重控制的結(jié)果。很多學(xué)者提出:“前腸學(xué)說(shuō)”和“后腸學(xué)說(shuō)”來(lái)解釋RYGB術(shù)對(duì)糖尿病的影響,但機(jī)制仍不清楚。我們前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí):2型糖尿病大鼠RYGB術(shù)后胰島細(xì)胞功能恢復(fù),胰島素抵抗改善。GLP-1、Ghr

4、elin、脂聯(lián)素在胰島細(xì)胞功能恢復(fù)方面起著重要作用,但缺少胰島素抵抗改善機(jī)制方面的研究。胰島素作用的靶組織主要為:骨骼肌、肝臟、脂肪。本實(shí)驗(yàn)主要選取骨骼肌作為研究對(duì)象。
　　 Ghrelin為生長(zhǎng)激素促分泌激素受體的內(nèi)源性配體,主分泌區(qū)為胃底X/A樣細(xì)胞,其受體在胰腺、下丘腦等多個(gè)臟器相繼被發(fā)現(xiàn)。大量文獻(xiàn)證實(shí):RYGB術(shù)后空腹Ghrelin明顯上升。另有研究表明,在Ghrelin基因敲除的oh/oh小鼠觀察到糖尿病的加重,而Ir

5、ako等報(bào)道,在鏈霉素誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型中,增加Ghrelin濃度可以預(yù)防糖尿病的發(fā)生,延緩糖尿病的發(fā)展。我們的臨床觀察和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)RYGB術(shù)后空腹Ghrelin上升,且Ghrelin可以抑制胰島細(xì)胞凋亡,促進(jìn)胰島素分泌,但是缺少胰島素抵抗方面作用的研究。故本實(shí)驗(yàn)著重于研究Ghrelin對(duì)胰島素抵抗的作用。
　　 胰島素受體底物(insulinreceptorsubstrate,IRS)是胰島素信號(hào)系統(tǒng)的關(guān)鍵介導(dǎo)因子,在維持

6、糖代謝中起著重要作用。磷酸化的IRS能激活啟動(dòng)胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致多種下游效應(yīng)器被激活,最終調(diào)節(jié)糖和脂類代謝。目前為止,IRS蛋白質(zhì)家族已經(jīng)有4個(gè)成員被鑒定出,即IRS-1、IRS-2、IRS-3和IRS-4。IRS-1主要作用在骨骼肌,IRS-2在調(diào)節(jié)肝臟糖原代謝,控制胰腺p細(xì)胞發(fā)展和生存方面起主要作用,而IRS-3和IRS-4在胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的作用微乎其微。相關(guān)文獻(xiàn)已證實(shí)胰島素作用的靶組織(如骨骼肌肉)中IRS.1的低表達(dá)

7、可以看作是胰島素抵抗的分子標(biāo)志之一。因此我們選取IRS為主要研究蛋白。
　　 本研究采用先天性T2DM大鼠Goto-Kakizaki(GK)和大鼠L6成肌細(xì)胞。第一步,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)RYGB術(shù)后GK大鼠胰島素抵抗緩解后,研究IRS是否發(fā)生變化:第二步,建立骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗模型,研究Ghrelin對(duì)骨骼肌胰島素抵抗作用及IRS的變化,探討胰島素抵抗改善機(jī)制,進(jìn)而明確RYGB治療T2DM的機(jī)制,為外科手術(shù)治療T2DM提供理論依據(jù)。

8、
　　 材料與方法:
　　 雄性Goto-Kakizaki(GK)大鼠30只隨機(jī)平均分為3組,分別為GK胃旁路手術(shù)組(RYGB組)和GK假手術(shù)組(GK-sham組),和GK對(duì)照組(GK組),10只Wistar大鼠作為正常對(duì)照組(WS組)。建立10周齡GK雄性大鼠RYGB手術(shù)模型,免疫組化檢測(cè)各組術(shù)后胰腺組織IRS-2表達(dá)變化,Westernblot檢測(cè)骨骼肌、肝臟中IRS-1,IRS-2蛋白變化。
　　 建立骨骼

9、肌細(xì)胞胰島素抵抗模型,通過(guò)不同濃度Ghrelin(10-8-10-10g/ml)作用后,檢測(cè)糖代謝變化,從而判斷胰島素抵抗改善情況;Westernblot檢測(cè)骨骼肌細(xì)胞IRS-1,IRS-2,GLUT-4蛋白表達(dá)變化,初步探討不同濃度Ghrelin對(duì)L6成肌細(xì)胞胰島素抵抗改善的作用機(jī)制。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,P＜0.05差異具有顯

10、著性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、RYGB手術(shù)對(duì)IRS受體表達(dá)的影響
　　 RYGB組術(shù)后28天胰腺組織免疫組化染色I(xiàn)RS-2表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性。蛋白質(zhì)印記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RYGB組與GK假手術(shù)組和GK對(duì)照組相比較,骨骼肌中IRS-1表達(dá)升高1.7倍,pIRS-1表達(dá)升高2.5倍,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),而各組骨骼肌dPIRS-2表達(dá)無(wú)明顯差別。RYGB組肝臟中IRS-2表達(dá)下降1.5倍,(P＜0.01vs.GK假

11、手術(shù)組和GK對(duì)照組),但仍高于Wistar組(P＜0.01)。各組肝臟中IRS-1表達(dá)差別無(wú)顯著性。
　　 二、Ghrelin對(duì)大鼠L6成肌細(xì)胞葡萄糖代謝影響
　　 1、Ghrelin處理組培養(yǎng)基上清液葡萄糖濃度低于空白對(duì)照組(P＜0.05),且隨Ghrelin濃度升高,培養(yǎng)基上清液葡萄糖濃度而呈下降趨勢(shì)。當(dāng)10-8g/ml時(shí),培養(yǎng)基上清液葡萄糖濃度最低。
　　 2、Ghrelin+胰島素組培養(yǎng)基上清液葡萄糖濃度

12、分別低于同濃度的Ghrelin及胰島素組(P＜0.05),說(shuō)明Ghrelin提高骨骼肌細(xì)胞胰島素敏感性,改善胰島素抵抗。
　　 3、蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)顯示,與空白對(duì)照組比較,各Ghrelin及胰島素處理組IRS-1、GLUT-4顯著升高(P＜0.01)。Ghrelin+胰島素組的IRS-1、GLUT-4表達(dá)水平與同濃度的Ghrelin,及胰島素組相比顯著升高(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、胃旁路手術(shù)后GK