高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠骨骼肌線粒體相關(guān)蛋白PGC-1α的表達及調(diào)控.pdf

1、近年來2型糖尿病的發(fā)病呈快速增長趨勢，目前估算到2030年全球糖尿病患病人數(shù)將超過3.5億。由糖尿病引起的死亡人數(shù)僅次于心腦血管疾病、惡性腫瘤，被稱為“第三殺手”，我國現(xiàn)有糖尿病人數(shù)目前居世界第二位。流行病學(xué)資料表明，隨年齡增加2型糖尿病患病率也明顯增加，是影響中老年人健康的主要疾病之一。與糖尿病相關(guān)的慢性并發(fā)癥如心腦血管疾病、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變以及糖尿病神經(jīng)病變是致死、致殘的主要原因，嚴重威脅人類健康。胰島素抵抗（insul

2、in resistanse，IR）是肥胖和2型糖尿病早期和重要的發(fā)病機制，其定義為由于肝臟、脂肪和肌肉等靶組織對胰島素生物效應(yīng)的反應(yīng)性降低。導(dǎo)致胰島素抵抗的具體機制尚不十分清楚。骨骼肌是機體葡萄糖、脂質(zhì)攝取和利用的器官，是胰島素發(fā)揮作用的重要組織。
　　 研究發(fā)現(xiàn)高脂引起骨骼肌線粒體相關(guān)蛋白PGC-1α，Mfn2、NRF-1表達下降，同時伴有胰島素信號通路相關(guān)蛋白的表達異常及胰島素抵抗，說明骨骼肌線粒體功能和胰島素抵抗關(guān)系密切，

3、而且PGC-1α可能在調(diào)控線粒體功能和胰島素抵抗方面發(fā)揮重要作用。
　　 本課題通過高脂飲食喂養(yǎng)老年大鼠，造成胰島素抵抗模型，分析胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下和羅格列酮（Rosiglitazone，RSG）干預(yù)后骨骼肌線粒體相關(guān)蛋白PGC-1α，mfn2、NRF-1的表達變化及相關(guān)關(guān)系，分析高脂飲食喂養(yǎng)老年大鼠線粒體功能和胰島素敏感性的變化。采用脂肪酸孵育C2C12肌細胞，了解不同類型脂肪酸對骨骼肌PGC-1α表達的影響，尋找細胞水平研究P

4、GC-1α作用機制的模型，并通過藥物和小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）技術(shù)調(diào)節(jié)肌細胞PGC-1α的表達，分析線粒體相關(guān)蛋白和胰島素信號通路相關(guān)蛋白的表達變化，探討PGC-1α在高脂、線粒體功能和胰島素抵抗中的作用機制及其上游調(diào)控因子，為研發(fā)防治胰島素抵抗和2型糖尿病的藥物提供新的作用靶點和理論依據(jù)。本實驗內(nèi)容主要包括以下四部分：
　　 第一部分 高脂誘導(dǎo)老年胰島素抵抗大鼠骨骼肌線粒體相關(guān)蛋

5、白的表達
　　 目的：測定高脂飲食喂養(yǎng)及羅格列酮干預(yù)老年大鼠的胰島素敏感性以及骨骼肌PGC-1α、Mfn2和NRF-1的表達變化，探討高脂與線粒體功能、IR的關(guān)系。
　　 方法：22-24月齡老年雄性Wistar大鼠40只隨機分為2組：老年對照（OC）組16只、老年高脂（OF）組24只，4-5月齡青年大鼠1 6只，為青年對照組（YC）。對照組給予基礎(chǔ)飼料，熱量組成：碳水化合物65.5％，脂肪10.3％，蛋白質(zhì)24.2％，

6、總熱量為348kcal/100g；OF組給予高脂飼料，其熱量組成：碳水化合物20.1％，脂肪59.8％，蛋白質(zhì)20.1％，總熱量為501kcal/100g；給予老年兩組大鼠每日等熱量投喂飼料，喂養(yǎng)八周。于喂養(yǎng)第四周末心臟采血測空腹血糖（FBG），胰島素（INS），血清甘油三酯（TG），血清總膽固醇（TC），游離脂肪酸（FFA）和骨骼肌甘油三酯（TGm）的含量。喂養(yǎng)四周末，每組均隨機選8只行高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗判斷胰島素抵抗情況，判

7、斷造模成功后高脂組隨機分為2組：高脂組和羅格列酮干預(yù)（OR）組，每組8只，除繼續(xù)給予高脂飼料外OR組給予羅格列酮3mg/kg灌胃，高脂組給予等量生理鹽水灌胃，繼續(xù)喂養(yǎng)四周。實驗第八周末，行高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗評價各組胰島素抵抗情況，實驗前抽取血樣用于測定血清各項指標(biāo)；實驗結(jié)束后頸動脈放血處死動物，留取股四頭肌標(biāo)本，-70℃保存。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及Western-blot方法檢測骨骼肌PGC-1α、Mfn2以及

8、NRF-1的表達。
　　 結(jié)論：1.高脂飲食喂養(yǎng)老年大鼠，血FFA升高，骨骼肌甘油三酯升高，葡萄糖輸注率下降，成功造成胰島素抵抗模型。2.高脂飲食喂養(yǎng)老年大鼠骨骼肌PGC-1α以及線粒體蛋白Mfn2和NRF-1表達下降。3.高脂飲食喂養(yǎng)的老年大鼠，其骨骼肌PGC-1α與Mfn2、NRF-1之間存在正相關(guān)關(guān)系。4.羅格列酮干預(yù)后，大鼠胰島素敏感性增強，骨骼肌PGC-1α、Mfn2和NRF-1表達升高，驗證了PGC-1α與線粒體功能

9、、IR的密切關(guān)系。
　　 第二部分 不同脂肪酸對C2C12肌細胞PGC-1α表達的影響
　　 目的：采用不同類型長鏈脂肪酸分別培養(yǎng)小鼠C2C12肌細胞，測定其PGC-1αmRNA和蛋白的表達，在細胞水平探討脂肪酸類型對骨骼肌PGC-1α的影響，為進一步研究PGC-1α與高脂、線粒體功能、胰島素抵抗的關(guān)系打基礎(chǔ)。
　　 方法：用含10％新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)C2C12肌細胞，接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后換為無血

10、清培養(yǎng)基，分別加入軟脂酸組（C16:0）、硬脂酸組（C18:0）、棕櫚酸組（C16:1）、油酸組（C18:1）以及亞油酸組（C18:2）孵育，均設(shè)置0.25mM、0.5 mM和0.75 mM三個濃度梯度，繼續(xù)培養(yǎng)24h。采用實時熒光定量PCR及Western-blot方法檢測細胞中PGC-1α的表達。
　　 結(jié)論：1軟脂酸孵育的C2C12肌細胞PGC-1α的mRNA和蛋白表達下降，并且有濃度和時間依賴性。2單不飽和或多不飽和脂肪

11、酸培養(yǎng)的C2C12肌細胞對PGC-1α表達無明顯影響。
　　 第三部分 C2C12肌細胞PGC-1α表達對線粒體相關(guān)蛋白和胰島素信號通路蛋白的影響
　　 目的：通過二甲雙胍、羅格列酮和AMPK激動劑（AICAR）孵育C2C12細胞，篩選上調(diào)PGC-1α效率最高的藥物，分別采用藥物上調(diào)和siRNA抑制PGC-1α的表達，分析PGC-1α表達變化對粒體功能相關(guān)蛋白和胰島素信號通路蛋白的影響，探討PGC-1α在線粒體功能紊亂、

12、IR中的作用。
　　 方法：細胞培養(yǎng)與傳代同第二部分。C2C12細胞分別以2mmol/l二甲雙胍、2mmol/l羅格列酮及10μmmol/l AMPK激動劑（AICAR）孵育30 min，然后加入0.5 mM的C16:0軟脂酸孵育24h，收取各組細胞并測定PGC-1α的表達。通過上述方法篩選出上調(diào)PGC-1α效率最高的藥物，采用此藥物上調(diào)PGC-1α（分對照組、軟脂酸組和藥物干預(yù)組）測定PGC-1α、Mfn2、NRF-1、IRS

13、-1以及GLUT4的蛋白表達。將C2C12細胞轉(zhuǎn)染PGC1α的特異性siRNA（PGC-1αsiRNA組）或無關(guān)序列對照siRNA（NS-siRNA組）6小時后以10μmmol/l AICAR孵育細胞48h，并設(shè)陰性對照組、AICAR組做為比較，分別測定PGC-1α、Mfn2、NRF-1、IRS-1以及GLUT4的蛋白表達。
　　 結(jié)論：1.二甲雙胍、羅格列酮以及AICAR干預(yù)均可以使軟脂酸孵育的C2C12細胞PGC-1α表達上

14、調(diào)，而AICAR的上調(diào)作用最明顯，二甲雙胍、羅格列酮以及AICAR可能逆轉(zhuǎn)了軟脂酸對C2C12的作用。2.藥物上調(diào)或siRNA下調(diào)C2C12細胞PGC-1α的表達同時伴有線粒體相關(guān)蛋白以及胰島素信號通路蛋白的變化，表明PGC-1α表達下降與線粒體功能異常及IR密切相關(guān)。3.高濃度軟脂酸誘導(dǎo)的線粒體功能下降由PGC-1α介導(dǎo)。
　　 第四部分MAPKs信號通路對C2C12肌細胞PGC-1α表達的調(diào)控作用
　　 目的：測定軟

15、脂酸培養(yǎng)的C2C12細胞ERK，p38MAPK（p38）和JNK的表達水平，并用p38MAPK抑制劑（SB203580）干預(yù)軟脂酸培養(yǎng)的C2C12細胞，測定PGC-1α的表達變化，揭示MAPKs信號通路與PGC-1α表達的關(guān)系，尋找軟脂酸誘導(dǎo)C2C12細胞PGC-1α表達變化的上游調(diào)節(jié)通路。
　　 結(jié)果：1軟脂酸培養(yǎng)的C2C12細胞ERK和JNK的表達：ERK和P-ERK以及JNK和P-JNK的表達在1h、6h、12h以及24h

16、較Oh無明顯變化，其差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。2軟脂酸培養(yǎng)的肌細胞p38MAPK的表達：p38MAPK的表達在1h、6h、12h以及24h較Oh無明顯變化，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。P-p38MAPK的表達在1h、6h、1 2h以及24h逐漸升高，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。3用p38MAPK抑制劑干預(yù)C2C12細胞后PGC-1α的表達：PGC-1α的表達在軟脂酸組與其它三組比較最低（P<0.01

17、），p38MAPK抑制劑組和軟脂酸+p38MAPK抑制劑組較軟脂酸組升高（P<0.01），p38MAPK抑制劑組最高（P<0.01）。
　　 結(jié)論：1.在軟脂酸培養(yǎng)的不同時間（0-12h）的C2C12細胞的p38MAPK表達無變化，而P-p38MAPK表達逐漸升高；2.在軟脂酸培養(yǎng)的不同時間（0-12h）的C2C12細胞ERK、P-ERK以及JNK、P-JNK表達無明顯變化；3.用p38MAPK抑制劑干預(yù)軟脂酸培養(yǎng)的C2C12細