長期高脂飲食對(duì)大鼠骨骼肌胰島素敏感性的影響及機(jī)制探討.pdf

1、背景： 生理劑量的胰島素發(fā)揮不了相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)即為胰島素抵抗，遺傳因素和環(huán)境因素均可誘導(dǎo)胰島素抵抗。近年來，隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，胰島素抵抗和2型糖尿病發(fā)病率逐漸增高，環(huán)境因素對(duì)胰島素抵抗的作用也引起人們更多的關(guān)注。其中，高脂飲食對(duì)胰島素敏感性的影響是近年來的研究熱點(diǎn)，即所謂脂毒性(lipotoxicity)。大量的流行病學(xué)資料提示：長期高脂飲食的人群胰島素抵抗和2型糖尿病發(fā)病率明顯高于正常人群：實(shí)驗(yàn)室資料也

2、證實(shí)：高脂環(huán)境可以損害包括骨骼肌、肝臟和脂肪在內(nèi)的多種胰島素靶器官的胰島素敏感性。目前認(rèn)為，高脂環(huán)境是誘發(fā)胰島素抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。 高脂環(huán)境誘導(dǎo)的胰島素抵抗伴有胰島素信號(hào)傳遞通路多個(gè)環(huán)節(jié)表達(dá)或活性的異常：如胰島素與受體的結(jié)合能力降低，胰島素受體、胰島素受體底物以及磷脂酰肌醇3激酶(PI<,3>K)活性下降，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GluT4)表達(dá)降調(diào)等。這些均被認(rèn)為是高脂環(huán)境誘導(dǎo)胰島素抵抗的可能機(jī)制。然而高脂環(huán)境下，上述胰島

3、素信號(hào)分子表達(dá)或活性改變的上游機(jī)制目前還不清楚。 AMPK(AMP-activated Potein Kinase)，即AMP激活的蛋白激酶，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞能量代謝的一種重要的調(diào)節(jié)因子。AMPK最主要的生物學(xué)效應(yīng)是通過感受胞漿內(nèi)AMP/ATP比值的變化，調(diào)節(jié)脂肪酸的氧化代謝。除調(diào)節(jié)能量代謝外，AMPK還參與機(jī)體胰島素敏感性調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK基因剔除的小鼠表現(xiàn)出明顯的胰島素抵抗，而AMPK過表達(dá)則具有明顯的胰島素增敏效應(yīng)

4、。目前認(rèn)為：AMPK是機(jī)體胰島素敏感性的一種正調(diào)節(jié)因子，其對(duì)胰島素敏感性的調(diào)節(jié)作用一方面與其對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)，另一方面AMPK還可直接調(diào)節(jié)GluT4的表達(dá)。 新近研究發(fā)現(xiàn)：高糖環(huán)境誘導(dǎo)的胰島素抵抗伴有AMPK活性的降調(diào)，提示AMPK很可能參與了高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗發(fā)生。高脂環(huán)境誘導(dǎo)的胰島素抵抗是否也伴有AMPK表達(dá)或活性的改變目前還不清楚。 Gs alpha和Gi alpha屬G蛋白受體家族成員，研究發(fā)現(xiàn)

5、二者也參與機(jī)體胰島素敏感性的調(diào)節(jié)。Gs alpha基因剔除的小鼠表現(xiàn)出明顯的胰島素敏感性增強(qiáng)；而Gi alpha基因剔除則可誘導(dǎo)胰島素抵抗。目前認(rèn)為：Gs alpha是機(jī)體胰島素敏感性的一種負(fù)調(diào)節(jié)因子；而Gi alpha則是機(jī)體胰島素敏感性的一種正調(diào)節(jié)因子。二者調(diào)節(jié)胰島素敏感性與胞漿cAMP水平有關(guān)。后者一方面可通過激活蛋白激酶A(PKA)使多種胰島素信號(hào)傳遞分子絲/蘇氨酸磷酸化失活；同時(shí)cAMP還可直接抑制GluT4的表達(dá)。

6、Gs alpha和Gi alpha表達(dá)和活性的改變與多種胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)發(fā)生有關(guān)：如飲酒、高糖環(huán)境、應(yīng)激以及肥胖相關(guān)胰島素抵抗等。新近研究發(fā)現(xiàn)：高脂環(huán)境可影響肝臟中Gs alpha和Gi alpha表達(dá)，并且與脂肪肝的發(fā)生密切相關(guān)。高脂環(huán)境能否通過影響骨骼肌中Gs alpha或Gi alphal表達(dá)誘導(dǎo)胰島素抵抗發(fā)生目前還不清楚。 目的： ①觀察長期高脂喂養(yǎng)對(duì)大鼠機(jī)體水平以及骨骼肌水平胰島素敏感性的影響。 ②觀察長

7、期高脂環(huán)境下，大鼠骨骼肌AMPKalpha亞基表達(dá)和活性的改變；進(jìn)而觀察AMPKalpha亞基表達(dá)或活性改變影響胰島素敏感性的下游機(jī)制：如MEF2的活性以及GluT4表達(dá)水平的變化等；進(jìn)一步，觀察加用AMPK激活劑是否對(duì)高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗的具有保護(hù)作用，探討AMPK在高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗中的地位和作用。 ⑧觀察長期高脂喂養(yǎng)對(duì)大鼠骨骼肌Gs alpha和Gi alpha及其介導(dǎo)的信號(hào)傳遞通路的影響，探討高脂環(huán)境是否通過影響Gs a

8、lpha和Gi alpha及其介導(dǎo)的信號(hào)傳遞通路，影響骨骼肌胰島素敏感性。 方法： ①大鼠分組及飼養(yǎng)：雄性Wistar大鼠30只，按體重隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(contr01)、高脂組(HF)和高脂加AMPK激活劑組(HF+MET)。對(duì)照組大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，其中碳水化合物熱卡占61％，脂肪熱卡占11％；高脂組和高脂加AMPK激活劑組大鼠均給予高脂飼料，其中脂肪熱卡占59％，以飽和脂肪酸為主(豬油)；AMPK激活劑選用二甲雙

9、胍(商品名格華止)，劑量為50mg·kg<'-1>·d<'-1>。每天早9點(diǎn)定時(shí)灌胃。各組大鼠每日膳食熱量控制在310KJ/只，喂養(yǎng)時(shí)間5個(gè)月。②機(jī)體水平胰島素敏感性評(píng)價(jià)：喂養(yǎng)期間監(jiān)測大鼠體重和血糖水平；大鼠處死前，測空腹血糖、空腹血胰島素和血脂水平，同時(shí)進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)；大鼠處死后，測內(nèi)臟脂肪含量。 ③骨骼肌水平胰島素敏感性評(píng)價(jià)：體外胰島素刺激實(shí)驗(yàn)檢測骨骼肌糖攝取能力。 ④長期高脂喂養(yǎng)對(duì)大鼠骨骼肌AMPKalp

10、ha表達(dá)和活性的影響：RT-PCR和Real-Time PCR檢測骨骼肌AMPKalphal亞基和AMPKalpha2亞基的mRNA水平；Western Blot檢測AMPKalpha亞基、磷酸化AMPKalpha亞基(P-AMPKa)以及磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(P-ACC)的蛋白水平；凝膠電泳遷移率(EMSA)檢測MEF2與GluT4啟動(dòng)子的結(jié)合活性；RT-PCR、Real-Time PCR和Westem Blot測定大鼠骨骼肌Glu

11、T4的表達(dá)水平。在此基礎(chǔ)上，觀察AMPK激活劑二甲雙胍對(duì)高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗的改善作用。 ⑤長期高脂喂養(yǎng)對(duì)大鼠骨骼肌Gs alpha和Gi alpha及其介導(dǎo)的信號(hào)傳遞通路的影響：RT-PCR、Real-Time PCR和Western blot分別檢測骨骼肌中Gs alpha和Gi alpha的mRNA和蛋白水平；Elisa測定骨骼肌胞漿cAMP的水平。結(jié)果： ①機(jī)體水平胰島素敏感性評(píng)價(jià) 與對(duì)照組相比，高脂組大

12、鼠體重增加51.1％(P<0.05)；空腹血糖增加21.5％(P<0.05)；服糖后2小時(shí)血糖升高28.3％(P<0.05)：空腹血胰島素水平升高17％(P<0.05)：內(nèi)臟脂肪含量增加106.6％(P<0.01)：血甘油三酯和膽固醇水平分別增加75％(P<0.01)和67.7％(P<0.01)，在機(jī)體水平上提示高脂組大鼠發(fā)生胰島素抵抗。 ②大鼠骨骼肌水平胰島素敏感性評(píng)價(jià) 與對(duì)照組相比：高脂組大鼠骨骼肌基礎(chǔ)狀態(tài)下葡萄糖攝

13、取水平降低37.2％(P<0.05)；胰島素刺激后葡萄糖攝取水平下降57.8％(P<0.01)；在骨骼肌水平進(jìn)一步證實(shí)高脂組大鼠發(fā)生胰島素抵抗。 ③高脂喂養(yǎng)對(duì)大鼠骨骼肌AMPKalpha表達(dá)和活性、MEF2活性以及GluT4表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比：高脂組大鼠骨骼肌AMPKalpha亞基蛋白水平下降58.7％(P<0.05)，磷酸化AMPKalpha亞基蛋白水平下降76.5％(P<0.05)，同時(shí)磷酸化ACC蛋白水平也

14、下降92.4％(p<0.05)，提示高脂環(huán)境可降調(diào)大鼠骨骼肌AMPKalpha亞基的表達(dá)和活性；mRNA水平分析結(jié)果顯示，高脂環(huán)境顯著降調(diào)AMPKalpha2亞基的表達(dá)(60.35％；p<0.05)，而對(duì)AMPKalphal亞基影響不明顯，進(jìn)一步提示主要是AMPKalpha2亞基參與高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗發(fā)生；EMSA結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高脂組大鼠骨骼肌MEF2活性下降59％(p<0.05)，同時(shí)GluT4的mRNA水平和蛋白水平分別下降53.8％

15、(p<0.01)和68.4％(p<0.01)，提示MEF2活性下降進(jìn)而導(dǎo)致GluT4表達(dá)降調(diào)是AMPKalpha表達(dá)和活性降低誘導(dǎo)胰島素抵抗可能的下游機(jī)制。 與高脂組相比，加用AMPK激活劑二甲雙胍可顯著改善高脂誘導(dǎo)的大鼠胰島素抵抗，具體表現(xiàn)為大鼠體重下降(24.7％，p<0.05)、血脂水平降低(p<0.01)、內(nèi)臟脂肪含量減少(38.3％，p<0.05)以及糖耐量改善(16％，p<0.05)；骨骼肌基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激后葡萄糖

16、攝取水平分別增加24.4％(p<0.05)和89.8％(p<0.01)；分子水平上的研究也發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍顯著增強(qiáng)MEF2的活性(p<0.05)以及GluT4的表達(dá)水平(P<0.05)。這些結(jié)果在另一個(gè)側(cè)面進(jìn)一步提示AMPKalpha亞基表達(dá)和活性的異常參與高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗發(fā)生。 ④高脂喂養(yǎng)對(duì)大鼠骨骼肌Gs alpha和Gi alpha表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比：高脂組大鼠骨骼肌Gi alpha的mRNA水平和蛋白水平

17、分別下降33％(p<0.05)和54.5％(p<0.05)，而Gs alpha的mRNA水平和蛋白水平變化不明顯。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：高脂喂養(yǎng)可顯著上調(diào)大鼠骨骼肌cAMP水平(66.4％；p<0.05)。上述結(jié)果提示：Gi alpha表達(dá)降調(diào)以及胞漿內(nèi)cAMP水平的增加也與高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗有關(guān)。 結(jié)論： ①長期高脂環(huán)境可誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗。 ②長期高脂環(huán)境可降調(diào)AMPKalpha亞基的表達(dá)和活性，進(jìn)而通過抑制ME