Resistin對(duì)肝臟胰島素敏感性及胰島β細(xì)胞功能的影響.pdf

1、脂肪組織在體內(nèi)過度積聚是肥胖的重要特征，胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能障礙則是2型糖尿病最主要的兩個(gè)病理生理學(xué)變化。長(zhǎng)期以來，研究者一直試圖闡明肥胖與2型糖尿病之間的關(guān)系，擬以脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如：游離脂肪酸(Free Fatty Acids，F(xiàn)FA)、腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factorα,TNF-α)、Leptin、Adiponectin等，來解釋胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能障礙的發(fā)生發(fā)展，但均未獲滿意結(jié)果。

2、 Resistin，是近年來通過差減雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的、由脂肪細(xì)胞分泌的胰島素抵抗候選分子。由于：1)飲食性或遺傳性肥胖小鼠血漿Resistin濃度明顯升高，禁食或TZDs類抗糖尿病藥物應(yīng)用后其血漿濃度明顯降低；2)重組Resistin能使正常小鼠出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗癥狀，而應(yīng)用Resistin中和抗體則能顯著改善胰島素抵抗的癥狀，因此.Resistin被認(rèn)為是聯(lián)系肥胖與2型糖尿病的紐帶。 胰島素抵抗涉及骨骼肌、脂肪、肝臟、胰

3、島等多個(gè)重要靶組織的功能變化。有關(guān)Resistin與骨骼肌、脂肪細(xì)胞胰島素抵抗關(guān)系的研究，近年來已有較多文獻(xiàn)報(bào)道，但對(duì)肝臟、胰島功能影響的研究卻并不多見，具體表現(xiàn)在：1)盡管有報(bào)道指出Resistin可嚴(yán)重影響肝細(xì)胞的糖代謝，但Resistin與肝細(xì)胞胰島素抵抗之間的關(guān)系及其具體機(jī)制卻并不清楚；2)葡萄糖刺激的胰島素分泌(Glucose stimulated insulinsecretion，GSIS)功能低下、胰島β細(xì)胞凋亡是構(gòu)成胰島

4、β細(xì)胞功能障礙的兩個(gè)重要方面，盡管目前研究證實(shí)Resistin可引發(fā)胰島細(xì)胞的GSIS功能障礙，但尚未見有關(guān)Rcsistin與胰島β細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究報(bào)道。 本研究分別以大鼠肝細(xì)胞H4IIE、大鼠胰島β細(xì)胞株RINm5F為研究工具，以初步闡明Resistin與肝臟胰島素抵抗、Resistin與胰島D細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。采用飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠和3T3-Ll前體脂肪誘導(dǎo)分化來初步探討Resistin的分泌。 第一部分 Res

5、istin對(duì)H4IIE肝細(xì)胞胰島素敏感性的影響及機(jī)制 目的：觀察Resistin對(duì)肝臟胰島素敏感性的影響，并初步探討其機(jī)制。 方法：1)體外培養(yǎng)大鼠H4IIE肝細(xì)胞株，以重組Resistin蛋白干預(yù)H4IIE肝細(xì)胞，通過檢測(cè)胰島素刺激的糖原合成，評(píng)估肝細(xì)胞胰島素敏感性的變化；2)以Resistin干預(yù)的H4IIE肝細(xì)胞為研究對(duì)象，采用Western Blot技術(shù)測(cè)定胰島素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中IRS-1、Akt、GSK-3

6、βD的總蛋白水平和磷酸化水平，采用RT-PCR、Western Blot技術(shù)檢測(cè)IRS負(fù)性調(diào)節(jié)因子SOCS-3的mRNA水平、蛋白水平，初步分析Resistin影響肝細(xì)胞胰島素敏感性的機(jī)制；3林外合成SOCS-3特異的ASO(anti.sense oligo)，轉(zhuǎn)染H4IIE肝細(xì)胞株以抑制SOCS-3的表達(dá)，以重組Resistin蛋白干預(yù)轉(zhuǎn)染有SOCS-3特異ASO的H4IIE肝細(xì)胞，通過檢測(cè)胰島素刺激的糖原合成，驗(yàn)證SOCS-3在Re

7、sistin致肝細(xì)胞胰島素敏感性變化機(jī)制中的作用。 結(jié)果：1)Resistin對(duì)胰島素刺激的肝細(xì)胞糖原合成具有抑制作用；2)Resistin抑制肝細(xì)胞中IRS-1，Akt、GSK-3β的活性，對(duì)IRS-Akt-GSK3整條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有抑制作用；3)Resistin上調(diào)肝細(xì)胞中IRS負(fù)性調(diào)節(jié)因子SOCS-3的mRNA水平、蛋白水平，SOCS-3特異ASO的應(yīng)用能顯著改善Resistin對(duì)胰島素刺激的肝細(xì)胞糖原合成的抑制作用。

8、 結(jié)論：1)Resistin可降低肝細(xì)胞的胰島素敏感性,誘導(dǎo)細(xì)胞胰島素抵抗;2)Resistin可能通過激活SOCS-3的機(jī)制,抑制胰島素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用,導(dǎo)致肝細(xì)胞胰島素抵抗. 第二部分 Resistin對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞功能的影響 目的：探討Rcsistin對(duì)胰島β細(xì)胞功能的影響，評(píng)價(jià)凋亡抑制蛋白TIMP-1在逆轉(zhuǎn)Resistin致胰島D細(xì)胞凋亡中的作用。 方法：體外培養(yǎng)RINm5F大鼠胰島D細(xì)胞

9、株，以重組Resistin蛋白或/和TIMP-1干預(yù)RINm5F胰島β細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，以Caspase-3活性、DNALadder凋亡特異性檢測(cè)指標(biāo)鑒定細(xì)胞凋亡，Western Blo檢測(cè)Iκ B-α總蛋白和磷酸化水平。 結(jié)果：1)大劑量(200ng/m1)Resistin能顯著降低RIN5F胰島β細(xì)胞的細(xì)胞活性，TIMP-1則能逆轉(zhuǎn)由ResistinSl起的RINm5F胰島β細(xì)胞活性降低；2)Resistin誘導(dǎo)R

10、INm5F胰島β細(xì)胞凋亡，TIMP-1則對(duì)Resistin誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡具有拮抗作用；3)Resistin能顯著上調(diào)IκB-αser32位點(diǎn)的磷酸化活性，TIMP-I則能抑制IκB-αser32位點(diǎn)磷酸化活性的上調(diào)。 結(jié)論：1)Resistin可影響胰島β細(xì)胞的功能，具有誘導(dǎo)RINm5F胰島β細(xì)胞凋亡的作用；2)Resistin可能通過上調(diào)IκB-αser32位點(diǎn)磷酸化活性的機(jī)制，誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡；3)TIMP-1可能夠

11、通過抑制IκB-αser32位點(diǎn)磷酸化活性的機(jī)制，拮kLResistin對(duì)RINm5F胰島β細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。 第三部分 3T3-L1脂肪細(xì)胞與飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠Resistin的分泌 目的：初步探討影響Rcsistin分泌的調(diào)節(jié)因素。 方法：1)體外培養(yǎng)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞株，誘導(dǎo)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞，于3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化過程的第0、4、6、8天收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清；2)以高

12、能量飼料誘導(dǎo)SD大鼠，制備飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型，模型制備成功后采集大鼠血清；3)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清、大鼠血清中的Resistin水平。 結(jié)果：1)隨3T3-L1前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的Resistin分泌量逐漸增加；2)肥胖大鼠血清中的Resistin水平顯著高于正常對(duì)照大鼠。 結(jié)論：1)脂肪細(xì)胞分泌Resistin的水平與脂肪細(xì)胞的成熟度有關(guān)；2)Resistin的分泌與機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀

13、態(tài)有關(guān)。 本研究創(chuàng)新之處在于：1)首次探討了RcsistiII對(duì)肝細(xì)胞H4IIE胰島素敏感性的影響，為ResistiIl致肝臟胰島素抵抗的理論提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)；2)通過觀察胰島素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在Resistin干預(yù)的肝細(xì)胞H4IIE中的變化，首次揭示Resistin誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗的機(jī)制在IRS水平，且通過激活SOCS-3來實(shí)現(xiàn)；3)首次闡明Rcsistin能通過誘導(dǎo)胰島D細(xì)胞凋亡的機(jī)制影響胰島功能，而TIMP-1具