MiR-802表達(dá)對(duì)肝臟胰島素敏感性和糖代謝的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、社會(huì)老齡化和生活方式的改變，肥胖和2型糖尿病發(fā)病率呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，已成為全球重要的公共健康問(wèn)題之一，而胰島素抵抗作為動(dòng)脈粥樣硬化、高脂血癥、2型糖尿病、肥胖等許多代謝性疾病的共同土壤，已成為研究的熱點(diǎn)。其中肝臟是機(jī)體物質(zhì)代謝中心，也是胰島素作用的重要器官，肝臟產(chǎn)生胰島素抵抗時(shí)會(huì)影響糖脂代謝，機(jī)體出現(xiàn)血糖升高，肝內(nèi)脂質(zhì)沉積，進(jìn)一步加重胰島素抵抗，二者形成惡性循環(huán)。
　　MicroRNA(又稱(chēng)miRNA)是一類(lèi)參與

2、基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子單鏈RNA。新近研究表明miRNA與肥胖和糖尿病關(guān)系密切。Higuchi等人通過(guò)miRNA芯片方法篩選出高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型肝臟及內(nèi)臟白色脂肪組織中miR-802的表達(dá)是上調(diào)的；與糖耐量正常的人群相比，糖尿病患者血清中miR-802表達(dá)升高，提示miR-802可能與糖代謝、胰島素抵抗有關(guān)，其具體關(guān)系和作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。
　　本課題首先通過(guò)HepG2細(xì)胞系構(gòu)建棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型，觀察m

3、iR-802與肝臟胰島素抵抗及糖代謝的關(guān)系，隨后通過(guò)在該細(xì)胞模型上轉(zhuǎn)染模擬物和抑制劑分別上調(diào)和下調(diào)miR-802的表達(dá)，進(jìn)一步確定miR-802對(duì)肝臟胰島素敏感性的調(diào)節(jié)作用；之后通過(guò)基因芯片對(duì)miR-802調(diào)節(jié)肝臟胰島素敏感性的潛在靶基因進(jìn)行篩選；最后通過(guò)尾靜脈注射腺相關(guān)病毒實(shí)驗(yàn)，在高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠模型上進(jìn)一步明確miR-802調(diào)節(jié)肝臟胰島素敏感性及糖代謝的機(jī)制，為闡明胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制、尋找新的藥物靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

4、>　　第一部分：MiR-802對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗及糖代謝的影響
　　目的：
　　應(yīng)用棕櫚酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞構(gòu)建胰島素抵抗細(xì)胞模型，通過(guò)上調(diào)或者下調(diào)miR-802的表達(dá)，觀察葡萄糖代謝和胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵指標(biāo)的變化，明確miR-802與肝臟糖代謝及胰島素敏感性的關(guān)系。
　　方法：
　　在棕櫚酸培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-802的模擬物或者抑制物來(lái)上調(diào)或者下調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)miR-802的表

5、達(dá)，分為以下六組：正常對(duì)照組（Con），棕櫚酸干預(yù)組（PA），棕櫚酸+miR-802模擬物組（miR-802-mimic）,棕櫚酸+模擬物對(duì)照組（mimic-negative control,mimic-NC）,棕櫚酸+miR-802抑制物組（miR-802-inhibitor），棕櫚酸+抑制物對(duì)照組(inhibitor-negative control, inhibitor-NC)。應(yīng)用化學(xué)法測(cè)定轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度；提

6、取miRNA及總RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miR-802的mRNA水平及胰島素信號(hào)通路IRS-2、PI3K和AKT及糖代謝G6PC和GSK-3β的mRNA表達(dá)。應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)相關(guān)總蛋白的變化和磷酸化表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.體外構(gòu)建HepG2細(xì)胞的IR模型
　　經(jīng)PA干預(yù)24小時(shí)后HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖含量PA組比正常對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示經(jīng)PA干預(yù)

7、后HepG2的胰島素敏感性下降，在體外實(shí)驗(yàn)中成功構(gòu)建了胰島素抵抗模型。
　　2.轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后各組miR-802的mRNA表達(dá)
　　與Con組相比，PA干預(yù)組的miR-802表達(dá)升高（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MiR-802-mimic組，其 miR-802的mRNA水平較對(duì)照mimic-NC組升高（P<0.05）；而miR-802-inhibitor組中miR-802的mRNA水平較對(duì)照inhibitor-N

8、C組降低（P<0.05）。
　　3.MiR-802的上調(diào)/下調(diào)對(duì)胰島素信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　3.1.胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定
　　與Con組相比，PA組HepG2細(xì)胞INSR、IRS-2、PI3K和AKT的mRNA表達(dá)下降；上調(diào)HepG2細(xì)胞miR-802的表達(dá)后，與對(duì)照組mimic-NC相比，PI3K的mRNA表達(dá)進(jìn)一步下降（P<0.05）；下調(diào)HepG2細(xì)胞miR-802的表達(dá)后，與對(duì)照組i

9、nhibitor-NC相比，PI3K的mRNA表達(dá)升高（P<0.05）。無(wú)論上調(diào)或者下調(diào)HepG2細(xì)胞miR-802的表達(dá)，INSR、IRS-2和AKT的mRNA表達(dá)無(wú)明顯改變（P>0.05）。
　　3.2.胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵基因的蛋白表達(dá)的變化
　　在PA干預(yù)組中IRS-2、PI3K和AKT總蛋白的表達(dá)較Con組無(wú)明顯變化，但I(xiàn)RS-2蛋白的絲氨酸磷酸化水平升高，PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平減少，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

10、<0.05）。上調(diào)HepG2細(xì)胞miR-802的表達(dá)后，與對(duì)照mimic-NC組相比，miR-802組IRS-2、PI3K和AKT總蛋白的表達(dá)無(wú)顯著性改變，但I(xiàn)RS-2蛋白的磷酸化水平進(jìn)一步升高，PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平均進(jìn)一步下降；下調(diào)HepG2細(xì)胞miR-802的表達(dá)后，與對(duì)照組inhibitor-NC組相比，miR-802-inhibitor組IRS-2、PI3K和AKT總蛋白的表達(dá)仍無(wú)顯著性改變，但I(xiàn)RS-2蛋白的磷酸化

11、水平降低，PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平升高。
　　4.MiR-802的上調(diào)/下調(diào)對(duì)糖代謝的影響
　　4.1.MiR-802的上調(diào)/下調(diào)對(duì)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的影響
　　與Con組相比，PA干預(yù)24小時(shí)后其培養(yǎng)基中葡萄糖濃度升高（P<0.05）；上調(diào)HepG2細(xì)胞miR-802的表達(dá)后，與對(duì)照mimic-NC組相比，miR-802組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度進(jìn)一步升高（P<0.05）；下調(diào)HepG2細(xì)胞miR-802的表達(dá)后，

12、與對(duì)照inhibitor-NC組相比，miR-802-inhibitor組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低（P<0.05）。
　　4.2.MiR-802的上調(diào)/下調(diào)對(duì)各組細(xì)胞葡萄糖代謝關(guān)鍵酶表達(dá)的變化
　　與Con組相比，PA組G6PC mRNA和蛋白表達(dá)均升高（P<0.05）；上調(diào)HepG2細(xì)胞miR-802的表達(dá)后，與對(duì)照mimic-NC組相比，G6PC的mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高（P<0.05）；下調(diào)HepG2細(xì)胞miR-80

13、2的表達(dá)后，與對(duì)照inhibitor-NC組相比，G6PC無(wú)論mRNA還是蛋白表達(dá)均降低（P<0.05）。
　　第二部分：MiR-802調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗及糖代謝的潛在機(jī)制和靶基因篩選
　　目的：
　　在明確miR-802對(duì)肝臟胰島素敏感性的調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)基因表達(dá)譜芯片和生物信息學(xué)方法篩選miR-802影響肝臟胰島素敏感性的潛在靶點(diǎn)，并通過(guò)Western-blot進(jìn)行體外驗(yàn)證。
　　方法：

14、
　　HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染同第一部分工作，取其中的棕櫚酸干預(yù)組（PA），棕櫚酸+miR-802模擬物組（miR-802-mimic，miR-802），棕櫚酸+模擬物對(duì)照組（mimic negative control, NC）交由上海伯豪生物技術(shù)有限公司公司進(jìn)行Human Genome U133 Plus2.0 Array型號(hào)的芯片檢測(cè)。通過(guò)對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析、功能富集分析篩選miR-802過(guò)表達(dá)所影響的信號(hào)通路，進(jìn)而推測(cè)m

15、iR-802調(diào)控肝臟糖代謝和胰島素敏感性的潛在機(jī)制。通過(guò)Targetscan對(duì)miR-802的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，同時(shí)結(jié)合芯片數(shù)據(jù)篩選出miR-802影響胰島素信號(hào)通路的靶基因，通過(guò)Western-blot在HepG2細(xì)胞上進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后各組miR-802的mRNA的表達(dá)
　　與PA干預(yù)組和對(duì)照NC組相比，過(guò)表達(dá)miR-802組，其miR-802的mRNA水平明顯升高（P<0.05）。<

16、br>　　2.芯片結(jié)果分析
　　2.1.主成份分析
　　對(duì)PA組、miR-802組和NC三組樣本進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖3所示。在該圖中，NC組和PA組的表達(dá)譜相近，說(shuō)明空載體轉(zhuǎn)染對(duì)整個(gè)體系無(wú)明顯影響；而這兩組與miR-802組在基因表達(dá)水平上有較大差異，說(shuō)明miR-802的過(guò)表達(dá)從整體上影響了HepG2細(xì)胞的基因表達(dá)。
　　2.2.差異基因篩選
　　由于主成份分析結(jié)果顯示NC組和PA組表達(dá)譜相近，因此我們以NC

17、組為對(duì)照，根據(jù)正文第二部分中2.3.2節(jié)的方法從miR-802組篩選差異基因，結(jié)果如圖3所示。與NC轉(zhuǎn)染組比較，miR-802轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞株中有505個(gè)基因發(fā)生了顯著上調(diào)（倍數(shù)值>2.0）；有104個(gè)基因受到顯著下調(diào)(倍數(shù)值>2.0）。
　　2.3.MiR-802過(guò)表達(dá)體系的功能富集分析
　　我們將差異基因分別映射到GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果如圖4所示。觀察圖4發(fā)現(xiàn)，在排名前10位的信號(hào)通路中，mi

18、R-802的過(guò)表達(dá)顯著影響了磷酸肌醇信號(hào)通路和肌醇磷酸鹽代謝通路（TOP3）。
　　芯片數(shù)據(jù)顯示，miR-802的過(guò)表達(dá)使磷酸肌醇3激酶調(diào)控亞單位2(Phosphoinositide3 kinase regulatory subunit,PIK3R2)的表達(dá)量減少約2倍，人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)表達(dá)升高

19、。PIK3R2是PI3K的調(diào)節(jié)亞基2，又被稱(chēng)為PI3KP85調(diào)節(jié)亞基β。而我們Western blot所用的PI3K的抗體檢測(cè)的是P85亞基的水平，因此在蛋白水平上檢測(cè)PI3KP85的表達(dá)可以代表PIK3R2的蛋白表達(dá)。PIK3R2可以促進(jìn)磷酸肌醇三磷酸（Phosphoinositide3 phosphoric acid，PIP3）的生成，而PTEN可以促進(jìn)PIP3去磷酸化從而生成PIP2。因此，下調(diào)的PIK3R2和上調(diào)的PTEN可能共

20、同抑制PIP3的生成，進(jìn)而降低下游AKT的磷酸化水平，影響肝細(xì)胞的糖代謝和胰島素敏感性。此外，該通路的上游調(diào)控基因細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3（suppressors of cytokine signaling3，SOCS3）在miR-802過(guò)表達(dá)組上調(diào)了1.9倍。SOCS3可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制IRS酪氨酸磷酸化，減少I(mǎi)RS與PI3K的調(diào)節(jié)亞單位 P85的結(jié)合。因此，上調(diào)的SOCS3可能進(jìn)一步抑制PI3K-AKT信號(hào)通路。同時(shí)，該通路的下游基因葡萄

21、糖6磷酸達(dá)組增加約1.7倍，提示miR-802可能通過(guò)PI3K-AKT通路促進(jìn)糖異酶催化亞基(Glucose6 phosphatase catalytic subunit,G6PC)在miR-802過(guò)表生過(guò)程。該機(jī)制如圖5所示。
　　綜上，miR-802的過(guò)表達(dá)可以使PI3K-AKT信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)量減少，SOCS3表達(dá)量增多，從而影響肝臟糖代謝過(guò)程，進(jìn)而影響葡萄糖穩(wěn)態(tài)及胰島素敏感性。
　　3.靶基因的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

22、　　在確定了miR-802影響糖代謝和胰島素敏感性等相關(guān)通路的基礎(chǔ)上，我們對(duì)其潛在的分子機(jī)制作了進(jìn)一步探索。通過(guò)Targetscan預(yù)測(cè)miR-802的靶基因，并結(jié)合表達(dá)譜芯片對(duì)預(yù)測(cè)到的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，取預(yù)測(cè)為陽(yáng)性且在miR-802過(guò)表達(dá)組顯著下調(diào)的基因作為miR-802的靶點(diǎn)，共篩選到17個(gè)候選靶基因，結(jié)果如圖7表所示。其中，肝細(xì)胞核因子（hepatocyte nuclear factor，HNF1B）是青年人中的成年發(fā)病型糖尿病（ma

23、turity-onset diabetes mellitus of theyoung,MODY）的重要致病基因，大量研究表明其與疾病的關(guān)系。根據(jù)Targetscan的預(yù)測(cè)結(jié)果，miR-802與HNF1B的mRNA的3’UTR端有大于6個(gè)理論結(jié)合位點(diǎn)（Fig.8）。MiR-802可以通過(guò)這些位點(diǎn)與HNF1B的mRNA結(jié)合，以達(dá)到抑制HNF1B轉(zhuǎn)錄的作用，從而抑制HNF1B蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)WB檢測(cè)該蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-802的過(guò)表

24、達(dá)使該基因下調(diào)約2倍（Fig9，Table3），提示HNF1B很可能是miR-802調(diào)控糖代謝的重要靶點(diǎn)。
　　第三部分：MiR-802通過(guò)HNF1B對(duì)高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟胰島素抵抗及糖代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制
　　目的：
　　在高脂誘導(dǎo)IR小鼠模型上，通過(guò)轉(zhuǎn)染腺相關(guān)病毒（adeno-associated viral，AAV）調(diào)節(jié)miR-802的表達(dá)，體內(nèi)觀察miR-802的上/下調(diào)對(duì)其靶基因HNF1和PI3K-AKT信號(hào)通路的影響

25、，同時(shí)檢測(cè)該通路上游基因和下游糖代謝通路上關(guān)鍵酶的表達(dá)，揭示miR-802-HNF1B這一信號(hào)通路體內(nèi)調(diào)控胰島素抵抗和糖代謝的潛在機(jī)制。
　　方法：
　　5周齡C57BL/6J小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為2組：對(duì)照組（Normal diet，ND）14只，高脂組（high fat diet,HFD）60只。對(duì)照組給予普通飼料D12450B喂養(yǎng)，熱量組成：碳水化合物70％，蛋白質(zhì)20%,脂肪10%，總熱量為385 kal/10

26、0g。高脂組給予高脂飲食D12492喂養(yǎng)，熱量組成：碳水化合物20%，蛋白質(zhì)20%,脂肪60%，總熱量為524 kal/100g。每日記錄攝食量，每周記錄兩次空腹體重，于高脂喂養(yǎng)12周后測(cè)空腹及進(jìn)食后血糖變化。每組隨機(jī)選6只小鼠行腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT），并留尾靜脈血清測(cè)胰島素水平，計(jì)算QUICKI值和葡萄糖曲線下面積(AUCglu)；隨后每組隨機(jī)選擇5只小鼠，處死后留取血及肝臟標(biāo)本。高脂誘導(dǎo)IR小鼠模型造模成功后，高脂模型

27、組通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-802的腺相關(guān)病毒來(lái)調(diào)節(jié)肝臟miR-802的表達(dá)，分為五組：?jiǎn)渭兏咧嬍辰M（High-fat diet, HFD）、高脂飲食+miR-802過(guò)表達(dá)組(miR-802)、高脂飲食+miR-802過(guò)表達(dá)對(duì)照組(GFP)、高脂飲食+miR-802敲低組(AAV-Sponge, miR-802-SP)、高脂飲食+miR-802敲低陰性對(duì)照組（AAV-Negative Control，NC)）。注射腺相關(guān)病毒4周后行IPGTT試

28、驗(yàn)，留取空腹尾靜脈血清測(cè)胰島素水平，并計(jì)算QUICKI值和AUCglu。隨后全部處死小鼠，留取血清及肝臟標(biāo)本，測(cè)定TC和TG，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組小鼠肝臟miR-802的表達(dá)，胰島素信號(hào)通路IRS-2、PI3K和AKT，及G6PC、SOCS3的mRNA水平。應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)IRS-2和AKT總蛋白及磷酸化水平及PI3K和靶基因HNF1B蛋白表達(dá)的變化。應(yīng)用試劑盒測(cè)定各組小鼠肝臟糖原含量、GK活性和PEP

29、CK活性。HE染色觀察小鼠肝臟形態(tài)變化。
　　結(jié)果：
　　1.高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠模型的建立
　　高脂飲食喂養(yǎng)12周后，HFD組小鼠體重高于ND組（P<0.05）；HFD組FBG水平較ND組略升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），進(jìn)食后血糖HFD組高于ND組，（P<0.01）；HFD組小鼠空腹血清INS、TC及TG水平高于ND組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　IPGTT結(jié)果示：HFD組15’、

30、30’、60’血糖均較ND組升高（P<0.05），HFD組AUCglu也顯著升高（P<0.05）。與ND組相比，HFD組定量胰島素敏感性指數(shù)（Quantitative Insulin Sensitivity Check Index,QUICKI=1/[log(I0)+log(G0)]）值明顯降低（P<0.05）。
　　2.轉(zhuǎn)染腺相關(guān)病毒后各組小鼠肝臟miR-802的mRNA水平比較
　　與ND組相比， HFD組小鼠肝臟miR

31、-802的mRNA水平明顯升高（P<0.05），轉(zhuǎn)染AAV后4周后，miR-802組肝臟miR-802的mRNA水平較對(duì)照GFP組明顯升高（P<0.05）；miR-802-SP組肝臟miR-802的mRNA水平較對(duì)照NC組明顯降低（P<0.05）；且在熒光顯微鏡下可以看到肝臟切片綠色熒光的表達(dá)，提示AAV轉(zhuǎn)染成功。
　　3.轉(zhuǎn)染腺相關(guān)病毒后胰島素敏感性相關(guān)指標(biāo)的變化
　　3.1.各組小鼠一般指標(biāo)的變化
　　注射AAV使

32、miR-802的表達(dá)量升高或者降低后，各干預(yù)組小鼠的體重及攝食量與HFD組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　給予AAV轉(zhuǎn)染上調(diào)/下調(diào)miR-802的表達(dá)量后，miR-802組的INS和TG較對(duì)照GFP組升高；miR-802-SP組的INS和TG較對(duì)照NC組降低（P<0.05）；然而各干預(yù)組間血清TC水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3.2.各組小鼠胰島素敏感性比較
　　IPGTT結(jié)果示：HFD組15’、

33、30’、60’血糖均較ND組升高（P<0.05），上調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后， miR-802組30’血糖較對(duì)照GFP組升高（P<0.05）；15’、60’、120’血糖均較對(duì)照GFP組升高（P>0.05）。下調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后， miR-802-SP組0’、30’血糖較對(duì)照NC組降低（P>0.05）。HFD組AUCglu高于ND組,而QUICKI值較ND組明顯降低（P<0.05）；上調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后，m

34、iR-802組AUCglu高于對(duì)照GFP組，而QUICKI值較對(duì)照GFP組降低（P<0.05）；下調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后，miR-802-SP組AUCglu較對(duì)照NC組降低，QUICKI值較對(duì)照NC組升高（P<0.05）。提示高脂組小鼠發(fā)生胰島素抵抗，上調(diào)/下調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后可影響胰島素敏感性。
　　4.PI3K-AKT通路的變化
　　4.1.PI3K-AKT通路上關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)比較
　　與N

35、D組相比， HFD組小鼠IRS-2、PI3K和AKT的mRNA表達(dá)下降（P<0.05）；上調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后，PI3K的mRNA表達(dá)較GFP組下降（P<0.05），下調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后，PI3K的mRNA表達(dá)較NC組升高。無(wú)論上調(diào)或者下調(diào)miR-802的表達(dá)，IRS-2和AKT的mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　4.2.PI3K-AKT信號(hào)通路的蛋白水平變化
　　與對(duì)照ND組相比， HFD組小鼠肝臟的P-

36、IRS-2/IRS-2的比值升高，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的比值降低；上調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后，p-IRS-2/IRS-2的比值較對(duì)照GFP組升高，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值降低，提示胰島素敏感性下降；下調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后，p-IRS-2/IRS-2的比值較對(duì)照NC組降低，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值升高（P<0.05），提示下調(diào)肝臟miR-802的表達(dá)后改善了肝臟

37、胰島素的敏感性。5 MiR-802靶基因HNF1B蛋白表達(dá)的變化
　　與對(duì)照ND組相比，HFD組小鼠HNF1B蛋白水平降低；上調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后，miR-802組HNF1B蛋白表達(dá)較GFP組明顯降低（P<0.05）；下調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后，miR-802-SP組HNF1B蛋白表達(dá)較NC組明顯升高；支持HNF1B是miR-802的靶基因。
　　6.肝臟糖代謝相關(guān)指標(biāo)的變化
　　6.1.肝臟糖原含量的

38、變化
　　與對(duì)照ND組相比，HFD組小鼠肝臟糖原含量降低；上調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后， miR-802組小鼠肝臟糖原含量較對(duì)照GFP組降低（P<0.05）；下調(diào)小鼠肝臟miR-802表達(dá)后，miR-802-SP組小鼠肝臟糖原含量較對(duì)照NC組升高（P<0.05）。
　　6.2.肝臟GK和PEPCK活性
　　與對(duì)照ND組相比，HFD組小鼠肝臟GK活性降低，PEPCK活性升高；上調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后，miR-80

39、2組小鼠肝臟GK活性較對(duì)照GFP組降低（P<0.05），PEPCK活性較對(duì)照GFP組明顯升高（P<0.05）；下調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后， miR-802-SP組小鼠肝臟GK活性較對(duì)照NC組升高（P<0.05），PEPCK活性較對(duì)照NC組明顯降低（P<0.05）。提示高脂飲食時(shí)肝臟糖異生增加，糖酵解減少，上調(diào)/下調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后可影響肝臟糖代謝。
　　6.3.各組小鼠G6PC和SOCS3的mRNA水平比較
　　與

40、對(duì)照ND組相比，HFD組小鼠肝臟G6PC和SOCS3的mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；上調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后，miR-802組小鼠肝臟G6PC和SOCS3的mRNA水平較對(duì)照GFP組升高（P<0.05）；下調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后， miR-802-SP組小鼠肝臟G6PC和SOCS3的mRNA水平較對(duì)照NC組降低（P<0.05）。
　　7.肝臟組織形態(tài)學(xué)比較
　　ND組肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉規(guī)則，

41、肝細(xì)胞排列整齊，在中央靜脈周?chē)史派錉罘植?，肝?xì)胞中央有大而圓的核，細(xì)胞質(zhì)均勻，未見(jiàn)脂滴和炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)；HFD組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫脹，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)脂滴空泡，且可見(jiàn)小葉內(nèi)及匯管區(qū)炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)；上調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后，miR-802組可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)明顯紊亂，肝細(xì)胞索消失，肝細(xì)胞變大，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量圓形脂滴空泡，重者胞質(zhì)疏松呈網(wǎng)狀改變，且小葉內(nèi)炎細(xì)胞侵潤(rùn)程度較對(duì)照GFP組增加。上調(diào)肝臟miR-802表達(dá)后，miR-8

42、02-SP組小鼠肝臟可見(jiàn)肝細(xì)胞體積較對(duì)照NC組變小，胞漿內(nèi)脂滴減少，小葉內(nèi)炎細(xì)胞侵潤(rùn)程度較對(duì)照組有所緩解。
　　結(jié)論：
　　1.在細(xì)胞和動(dòng)物水平驗(yàn)證了IR模型中miR-802的表達(dá)升高，并且與胰島素抵抗和糖代謝異常有關(guān)。。
　　2.在IR細(xì)胞模型上，通過(guò)表達(dá)譜芯片和靶基因預(yù)測(cè)軟件篩選出miR-802的潛在靶點(diǎn)HNF1B，進(jìn)一步的功能富集分析提示miR-802可能通過(guò)該靶點(diǎn)調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號(hào)通路，進(jìn)而影響肝臟胰島素