重組人白介素6對(duì)SW872脂肪細(xì)胞糖代謝和胰島素敏感性的影響及其機(jī)制的探討.pdf

1、第一部分油酸誘導(dǎo)SW872前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞 目的:觀察油酸對(duì)SW872前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用 方法: 1.光學(xué)顯微鏡觀察SW872前脂肪細(xì)胞形態(tài)的變化。 2.油紅0染色觀察胞漿中脂滴的聚集。 3.化學(xué)比色法測(cè)定細(xì)胞中甘油三酯的總量。 結(jié)果: 1.0.6mMoleicacid誘導(dǎo)分化刺激24h時(shí)，SW872前脂肪細(xì)胞胞體由大變小，形態(tài)由梭形變?yōu)閳@形；誘導(dǎo)分化刺激48h

2、時(shí)，細(xì)胞體積變大，幾乎所有細(xì)胞形態(tài)變園；誘導(dǎo)分化72h時(shí)，細(xì)胞呈戒環(huán)狀。 2.0.6mMoleicacid誘導(dǎo)分化刺激24h時(shí)，胞漿中出現(xiàn)細(xì)小的脂滴；誘導(dǎo)分化刺激48h時(shí)，胞漿中脂滴明顯增多；誘導(dǎo)分化72h時(shí)，胞漿脂滴含量更多，油紅0染色胞漿中可見(jiàn)豐富的脂肪染色。 3.0.6mMoleicacid誘導(dǎo)分化刺激24h時(shí)，細(xì)胞中甘油三酯總量增多；誘導(dǎo)分化刺激48h時(shí)，甘油三酯總量是分化前的8.5倍(p＜0.01)；誘導(dǎo)分化刺

3、激72h時(shí)，甘油三酯總量是分化前的14倍(p＜0.01)。 結(jié)論:0.6mMoleicacid刺激72h，能成功地將SW872前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為典型的成熟脂肪細(xì)胞。 第二部分重組人白介素6對(duì)SW872脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)位的影響 目的:觀察重組人IL-6對(duì)SW872脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4的蛋白表達(dá)及其轉(zhuǎn)位的影響，探討rhIL-6與脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的關(guān)系及其機(jī)制；

4、同時(shí)觀察JAK2的抑制劑AG490及PI3K的抑制劑Wortmannin是否影響rhIL-6對(duì)SW872脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制作用，以探討在SW872脂肪細(xì)胞PI3K信號(hào)系統(tǒng)與JAK/STAT信號(hào)系統(tǒng)是否存在信息交換。 方法: 1.采用2-脫氧-3H-D葡萄糖攝入法，觀察基礎(chǔ)狀態(tài)及胰島素刺激下，不同濃度rhIL-6對(duì)SW872脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率的影響。 2.激光共聚焦顯微鏡觀察GLUT4的蛋白表達(dá)，以觀察rh

5、IL-6對(duì)SW872脂肪細(xì)胞GLUT4蛋白表達(dá)的影響。 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜GLUT4的蛋白含量，觀察胰島素刺激下，rhIL-6對(duì)SW872脂肪細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)位的影響。 結(jié)果: 1.在基礎(chǔ)狀態(tài)及胰島素刺激下，1ng/mlrhIL-6作用24h，對(duì)SW872脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率無(wú)影響；5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/mlrhIL-6使基礎(chǔ)狀態(tài)及胰島素刺激下SW872脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取率

6、分別下降16.6％vs20.9％、28.5％vs36.0％、39.5％vs50.1％、47.6％vs57.1％。2.Jak2抑制劑AG490預(yù)處理，使rhIL-6對(duì)SW872脂肪細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)及胰島素刺激下葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制作用分別降低20％及33％。PI3K抑制劑Wortmannin預(yù)處理，增加基礎(chǔ)狀態(tài)及胰島素刺激下rhIL-6對(duì)SW872脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制作用。 3.20ng/mlrhIL-6作用24h，抑制SW872脂

7、肪細(xì)胞GLUT4的蛋白表達(dá)，與對(duì)照組相比P＜0.01。 4.20ng/mlrhIL-6作用24h，SW872脂肪細(xì)胞細(xì)胞膜GLUT4蛋白含量明顯降低，與對(duì)照組相比P＜0.01。 結(jié)論: 1、rhIL-6抑制基礎(chǔ)狀態(tài)及胰島素刺激下SW872脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)胰島素刺激條件下的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制作用更明顯，且呈劑量相關(guān)效應(yīng)。 2、在SW872脂肪細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)系統(tǒng)及PI3K信號(hào)系統(tǒng)存在交互作用。3

8、、rhIL-6抑制SW872脂肪細(xì)胞GLUT4的蛋白表達(dá)。 4、rhIL-6抑制SW872脂肪細(xì)胞GLUT4的轉(zhuǎn)位。 5、rhIL-6降低SW872脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，誘導(dǎo)胰島素抵抗的形成。 第三部分重組人白介素6對(duì)SW872脂肪細(xì)胞細(xì)胞因子基因和蛋白表達(dá)的影響 目的:觀察rhIL-6對(duì)SW872脂肪細(xì)胞細(xì)胞因子(脂聯(lián)素、抵抗素、促?；鞍准鞍捉樗?)基因及蛋白表達(dá)的影響，以探討rhIL-

9、6對(duì)脂肪細(xì)胞分泌功能的調(diào)節(jié)作用。 方法; 1.ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中脂聯(lián)素及促?；鞍椎暮?。 2.RT-PCR方法檢測(cè)SW872脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素、抵抗素、白介素6的mRNA水平。 結(jié)果: 1.對(duì)脂聯(lián)素的影響：1ng/ml及5ng/mlrhIL-6作用24h，對(duì)SW872脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素基因及蛋白的表達(dá)無(wú)影響；10ng/ml、20ng/ml及50ng/mlrhIL-6作用24h，抑制SW87

10、2脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素基因及蛋白的表達(dá)。20ng/mlrhIL-6作用4h，對(duì)SW872脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素基因及蛋白的表達(dá)無(wú)影響；隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，rhIL-6抑制SW872脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA及蛋白的表達(dá)，且對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用更強(qiáng)。 2.對(duì)白介素6的影響：1ng/mlrhIL-6作用24h，對(duì)SW872脂肪細(xì)胞IL-6mRNA的表達(dá)無(wú)影響，隨著rhIL-6濃度的增加，可促進(jìn)SW872脂肪細(xì)胞IL-6mRNA的表達(dá)，但以20ng/m

11、lrhIL-6的作用最強(qiáng)；20ng/mlrhIL-6作用4h即可促進(jìn)SW872脂肪細(xì)胞IL-6mRNA的表達(dá)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)其促進(jìn)作用更加明顯。 3.對(duì)抵抗素的影響：不同濃度及不同作用時(shí)間，rhIL-6對(duì)SW872脂肪細(xì)胞抵抗素mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響，與對(duì)照組相比P＞0.05。 4.對(duì)促?；鞍椎挠绊懀?ng/mlrhIL-6作用24h對(duì)SW872脂肪細(xì)胞ASP的分泌沒(méi)有影響；而5ng/ml、10ng/ml、20n

12、g/ml、50ng/mlrhIL-6作用24h對(duì)SW872脂肪細(xì)胞ASP的分泌具有不同程度的抑制作用，且隨rhIL-6濃度的增加對(duì)ASP分泌的抑制作用越明顯。20ng/mlrhIL-6作用4h即對(duì)SW872脂肪細(xì)胞ASP的分泌即有抑制作用，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用更明顯，但以rhIL-6作用12h對(duì)ASP分泌的抑制作用最明顯。 結(jié)論: 1.rhIL-6以劑量和時(shí)間相關(guān)的方式，抑制SW872脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素mRNA及蛋白

13、的表達(dá)。 2.rhIL-6以劑量和時(shí)間相關(guān)的方式促進(jìn)SW872脂肪細(xì)胞IL-6mRNA表達(dá)。表明在SW872脂肪細(xì)胞IL-6以劑量和時(shí)間相關(guān)的方式誘導(dǎo)自身的表達(dá)，脂肪細(xì)胞IL-6mRNA表達(dá)受自分泌正反饋調(diào)節(jié)。 3.rhIL-6以劑量和時(shí)間相關(guān)的方式，抑制SW872脂肪細(xì)胞促酰化蛋白的分泌。4.rhIL-6對(duì)SW872脂肪細(xì)胞抵抗素mRNA的表達(dá)無(wú)影響。 5.rhIL-6通過(guò)影響SW872脂肪細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)而