線粒體融合蛋白2對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠骨骼肌脂肪代謝的影響.pdf

1、胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)是指外周組織（骨骼肌、脂肪和肝臟）對(duì)胰島素的敏感性降低，表現(xiàn)為外周組織對(duì)葡萄糖的攝取和利用障礙。近年來(lái)研究認(rèn)為，骨骼肌組織內(nèi)脂代謝中間產(chǎn)物如甘油二酯、神經(jīng)酰胺、長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A的沉積增加是誘導(dǎo)骨骼肌產(chǎn)生IR的主要原因。
　　 脂肪酸是人及哺乳動(dòng)物的主要能源物質(zhì)，脂肪酸的攝入超出其氧化能力是骨骼肌內(nèi)脂肪堆積的主要原因。脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(fatty acid translocase，

2、CD36)是促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞攝取脂肪酸的重要膜蛋白。進(jìn)入細(xì)胞中的脂肪酸需進(jìn)入線粒體內(nèi)進(jìn)行代謝，肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(camitine palmitoyltransferase 1，CPTl)在脂肪酸由胞液向線粒體基質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)中起關(guān)鍵作用。
　　 胰島素抵抗及脂質(zhì)沉積發(fā)病機(jī)理的關(guān)鍵因子之一是線粒體功能受損，而線粒體融合蛋白2（mitofusin2，MFN2）對(duì)線粒體功能有重要的影響。越來(lái)越多的研究表明MFN2表達(dá)與胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)相關(guān)，但具體

3、機(jī)制仍不清楚。本研究通過高脂飲食構(gòu)建大鼠胰島素抵抗模型，用MFN2腺病毒進(jìn)行干預(yù)，探討MFN2是否可通過改善線粒體功能，增加CPT1的表達(dá)，從而減少骨骼肌脂質(zhì)代謝中間產(chǎn)物的沉積，進(jìn)而改善胰島素抵抗。
　　 目的:探討MFN2對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠骨骼肌脂質(zhì)沉積及脂肪酸代謝中CD36及CPT1的影響極其機(jī)制。
　　 方法:64只雄性SD大鼠隨機(jī)分為2組，正常對(duì)照組(8N)16只、高脂飲食組(8F)48只，正常對(duì)照組

4、給予普通飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組給予高脂飼料喂養(yǎng)8周，應(yīng)用清醒狀態(tài)下高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)判斷高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗模型成功，之后各組隨機(jī)選取8只大鼠，腹主動(dòng)脈取血處死動(dòng)物，血糖(blood glucose，BG)應(yīng)用快速血糖儀測(cè)定;血甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定;ELISA試劑盒測(cè)定血清胰島素(insulin，INS)，骨骼肌甘油二酯(diacy

5、lglycerols，DAG)、神經(jīng)酰胺(ceramides，CEA)、長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A(long chain fatty acid CoAs，LCACoAs)的變化;GPO-PAP酶法測(cè)定骨骼肌甘油三酯含量的變化;透射電鏡觀察大鼠骨骼肌線粒體形態(tài)變化;用RT-PCR和Westernblot的方法分析大鼠骨骼肌CD36及CPT1的mRNA和蛋白的表達(dá)。之后將剩余高脂飲食組大鼠隨機(jī)分為:高脂對(duì)照組(Control)、空病毒組(Ad)、MFN

6、2低劑量組(Ad-MFN2108)、MFN2中劑量組(Ad-MFN2109)、MFN2高劑量組(Ad-MFN21010)各8只，分別應(yīng)用PBS、MFN2空病毒或不同劑量MFN2腺病毒鼠尾靜脈注射干預(yù)三周，高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)評(píng)估各組大鼠胰島素抵抗程度，之后處死各組大鼠，BG應(yīng)用快速血糖儀測(cè)定;TG、TC應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定;ELISA試劑盒測(cè)定INS，骨骼肌DAG、CEA、LCACoAs的變化;GPO-PAP酶法測(cè)定骨骼肌甘油三

7、酯含量的變化;電鏡觀察大鼠骨骼肌線粒體形態(tài)變化;RT-PCR和Westernblot的方法分析大鼠骨骼肌CD36及CPT1的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1、高脂飲食喂養(yǎng)8周，指標(biāo)變化:(1)胰島素抵抗大鼠模型制作成功:高脂飲食喂養(yǎng)8周后，高脂組BG[(7.2±0.6vs5.7±0.7)mmol/L]及INS[(40.6±3.9vs28.7±3.3)mU/L]明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），葡萄糖輸注

8、率(GIR)明顯低于正常對(duì)照組[(17.7±2.3vs29.4±2.4)mg/kg/min]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(2)血脂水平的變化:高脂飲食喂養(yǎng)8周后，高脂組大鼠血TC[(1.51±0.07vs1.13±0.06)mmol/L]，TG[(0.35±0.04vs0.22±0.02)mmol/L]明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(3)大鼠骨骼肌線粒體形態(tài)的變化:正常對(duì)照組肌細(xì)胞中細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完好，線粒體

9、豐富，胞漿內(nèi)無(wú)脂滴及脫顆?，F(xiàn)象，線粒體膜、嵴結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則;高脂組肌細(xì)胞內(nèi)可見大量大小不等的脂滴分布，線粒體有一定程度的腫脹，內(nèi)外膜部分融合，線粒體嵴變少變短，部分或全部消失，甚至出現(xiàn)空泡化。(4)骨骼肌脂質(zhì)沉積結(jié)果:高脂飲食喂養(yǎng)8周后，與正常飲食對(duì)照組相比，高脂組骨骼肌組織中甘油三酯[(27.9±1.8vs9.6±0.9)μmol/g]，甘油二酯[(563.0±48.3vs211.5±31)nmol/g]，神經(jīng)酰胺[(130.3±

10、9.3vs67.2±12.2)nmol/g]，LCACoAs[(6.0±0.8vs2.2±0.31)nmol/g]的含量均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。(5)CD36、MFN2及CPT1的mRNA和蛋白的表達(dá):高脂組骨骼肌組織中CD36mRNA和蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照組(P＜0.01)，CPT1、MFN2的mRNA和蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯下降(P＜0.01)。
　　 2、MFN2干預(yù)3周后，指標(biāo)變化:(1)胰島素

11、抵抗程度的變化:MFN2干預(yù)3周后，MFN2干預(yù)組骨骼肌組織中MFN2mRNA和蛋白的表達(dá)與空病毒組相比明顯升高(P＜0.01);MFN2干預(yù)組GIR明顯高于空病毒組[(Control:17.74±2.34,Ad:17.91±2.56,Ad-MFN2108:24.27±3.97,Ad-MFN2109:28.16±4.71,Ad-MFN21010:29.22±3.18)mg/kg/min],BG[(Control:7.18±0.6，Ad:

12、7.2±0.7，Ad-MFN2108:6.2±0.5，Ad-MFN2109:5.9±0.7，Ad-MFN21010:5.8±0.8)mmol/L]及INS[(Control:40.0±5.9，Ad:40.1±5.9，Ad-MFN2108:32.7±3.9,Ad-MFN2109:30.9±3.7,Ad-MFN21010:30.7±3.1)mU/L]均明顯下降(P＜0.01)。(2)大鼠血脂水平的變化:與空病毒組相比，MFN2干預(yù)組大鼠血T

13、G[(Control:0.14±0.015，Ad:0.13±0.01，Ad-MFN2108:0.12±0.01,Ad-MFN2109:0.11±0.01,Ad-MFN21010:0.11±0.01)mmol/L]及TC[(Control:1.13±0.1,Ad:1.09±0.09,Ad-MFN2108:1.03±0.11,Ad-MFN2109:1.00±0.08，Ad-MFN21010:1.02±0.04)mmol/L]無(wú)明顯變化(P＞

14、0.05)。(3)大鼠骨骼肌電鏡結(jié)果:Ad-MFN2不同劑量干預(yù)組與空病毒組相比脂滴數(shù)量少，線粒體腫脹減輕，內(nèi)外膜部分融合。(4)大鼠骨骼肌脂質(zhì)沉積結(jié)果:MFN2干預(yù)組DAG[(Control:562.5±60.4，Ad:547.3±69.6，Ad-MFN2108:437.8±63.4,Ad-MFN2109:369.7±66.5,Ad-MFN21010:355.5±48.8)nmol/g]、CER[(Control:134.2±11.1

15、,Ad:138.3±12.4,Ad-MFN2108:87.8±10.9,Ad-MFN2109:84.8±14.9,Ad-MFN21010:75.7±12.2)nmol/g]、LCACoAs[(Control:6.6±0.8,Ad:6.4±0.7,Ad-MFN2108:3.8±0.6,Ad-MFN2109:3.0±0.6,Ad-MFN21010:2.1±0.5)nmol/g]的含量明顯下降(P＜0.01)，甘油三酯的含量無(wú)明顯變化[(Co

16、ntrol:24.3±3.1，Ad:23.1±3.2，Ad-MFN2108:21.1±3.0，Ad-MFN2109:19.5±2.2,Ad-MFN21010:20.1±2.3)μmol/g](P＞0.05)。(5)CD36及CPT1的mRNA和蛋白的表達(dá):MFN2干預(yù)各組CD36的mRNA和蛋白的表達(dá)與空病毒組相比無(wú)明顯變化;MFN2干預(yù)各組CPT1mRNA和蛋白的表達(dá)與空病毒組相比明顯升高(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:

17、>　　 1、高脂飲食使大鼠空腹血糖及胰島素升高，葡萄糖輸注率明顯下降，造成胰島素抵抗，MFN2干預(yù)可改善高脂飲食引起的大鼠胰島素抵抗。
　　 2、高脂飲食導(dǎo)致線粒體腫脹，內(nèi)外膜部分融合，線粒體嵴變少變短，部分或全部消失，甚至出現(xiàn)空泡化;MFN2干預(yù)后線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷減輕。
　　 3、高脂飲食導(dǎo)致大鼠高甘油三酯血癥及高膽固醇血癥，并導(dǎo)致骨骼肌脂質(zhì)及其中間代謝產(chǎn)物的沉積，MFN2干預(yù)可改善高脂飲食引起的骨骼肌脂質(zhì)沉積，而