Mfn2表達(dá)對(duì)高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠肝臟糖、脂代謝的影響及機(jī)制研究.pdf

1、近年來，2型糖尿病的患病率有急劇增加的趨勢(shì)，據(jù)估計(jì)到2025年，患糖尿病的人數(shù)將超過3億。胰島素抵抗是肥胖和2型糖尿病早期重要的發(fā)病機(jī)制，已經(jīng)成為重要公眾健康問題。胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下存在糖類和脂肪代謝效率降低。線粒體是機(jī)體能量代謝和供給的核心細(xì)胞器，在代謝性疾病中的作用不容忽視。已有研究表明線粒體功能障礙與胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，可能是胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制之一。線粒體功能異常包括氧化能力的降低及ATP合成的減少，可導(dǎo)致脂質(zhì)沉

2、積，引起胰島素抵抗。
　　線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的維持在調(diào)節(jié)能量代謝中發(fā)揮重要作用。線粒體是一種動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，通過不斷的融合和斷裂過程來維持其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及功能。線粒體融合蛋白(mitofusin，Mfn)促進(jìn)線粒體融合，調(diào)節(jié)線粒體生物合成及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的維持。而Mfn2是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中介導(dǎo)線粒體融合的關(guān)鍵蛋白之一。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ捅砻魃砘虿±頎顟B(tài)可導(dǎo)致Mfn2表達(dá)的改變，如糖尿病、肥胖、胰島素抵抗下調(diào)Mfn2表達(dá)，而運(yùn)動(dòng)和體重減輕則上調(diào)Mf

3、n2表達(dá)。有研究報(bào)道，下調(diào)Mfn2表達(dá)使線粒體膜電位降低、氧耗及葡萄糖氧化能力降低，而上調(diào)Mfn2表達(dá)使線粒體膜電位增加，氧耗及葡萄糖氧化能力增強(qiáng)。先前研究表明高脂飲食下調(diào)了胰島素抵抗大鼠骨骼肌Mfn2表達(dá)。
　　越來越多的研究表明Mfn2表達(dá)與胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)相關(guān)，但具體機(jī)制仍不清楚。本課題通過高脂飲食喂養(yǎng)大鼠建立胰島素抵抗模型，同時(shí)用飽和脂肪酸孵育HepG2細(xì)胞建立胰島素抵抗細(xì)胞模型，采用重組腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法上調(diào)Mfn2

4、表達(dá)，研究Mfn2對(duì)胰島素抵抗大鼠肝臟糖、脂代謝的的影響，分別在動(dòng)物和細(xì)胞水平探討其改善胰島素抵抗的具體分子機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下四部分：
　　第一部分高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗發(fā)生及對(duì)肝臟Mfn2表達(dá)的影響
　　目的：建立高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗動(dòng)物模型，觀察高脂對(duì)大鼠肝臟Mfn2表達(dá)的影響。
　　方法：雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠84只，體重60-80 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組

5、(normal diet，ND)12只和高脂組(high-fat diet，HFD)72只。ND組給予基礎(chǔ)飼料，熱量組成為脂肪10.3%，碳水化合物65.5%，蛋白質(zhì)24.2%，總熱量為348kcal/100g；HFD組給予高脂飼料，其熱量組成為：脂肪59.8%，碳水化合物20.1%，蛋白質(zhì)20.1%，總熱量為501 kcal/100g。所有動(dòng)物自由攝食飲水，明暗周期為12 h(6 am-6pm)，室溫20℃-23℃。實(shí)驗(yàn)第8周末，兩組

6、分別隨機(jī)選出6只進(jìn)行清醒狀態(tài)下高胰島素-正葡萄糖鉗夾(hyperinsulinaemic euglycaemic clamp)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算葡萄糖輸注率(glucose infusion rate，GIR)，評(píng)價(jià)胰島素敏感性。判斷造模成功后，處死大鼠，留取血清及肝組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。血糖(blood glucose，BG)應(yīng)用快速血糖儀測(cè)定。血漿胰島素(insulin，INS)、游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)檢測(cè)采用

7、ELISA試劑盒測(cè)定。血甘油三酯(triglyceride，TG)及總膽固醇(total cholesterin，TC)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。肝組織Mfn2 mRNA及蛋白水平分別采用Real time PCR及Western blot方法檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1兩組大鼠一般指標(biāo)的比較
　　各組大鼠體重隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，HFD組大鼠體重(357.0±32.5 g)與ND組(355.7±39.0 g)相比，差異無統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)意義(P>0.05)。HFD組FBG水平(5.72±0.43 mmol/L)高于ND組(5.21±0.38 mmol/L)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HFD組INS水平(37.59±7.02 mU/L)高于ND組(27.24±4.68 mU/L)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HFD組血TG水平(0.32±0.09 mmol/L)高于ND組(0.24±0.05 mmol/L)；HFD組血TC水平(1.42±0.17 mmo

9、l/L)較ND組(1.16±0.15 mmol/L)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HFD組血FFA水平(0.80±0.12 mol/L)較ND組(0.60±0.08 mol/L)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　2兩組大鼠葡萄糖輸注率的比較
　　HFD組GIR(13.66±2.54 mg/(kg·min))較ND組(28.14±5.00mg/(kg·min))顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

10、r>　　3兩組大鼠肝臟Mfn2 mRNA及蛋白水平的比較
　　HFD組大鼠肝臟Mfn2 mRNA表達(dá)水平(0.23±0.04)較ND組(0.91±0.14)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。HFD組Mfn2蛋白含量(0.28±0.05)較ND組(0.87±0.07)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　4肝組織形態(tài)學(xué)的比較
　　光鏡下觀察：ND組肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝小葉規(guī)則，肝細(xì)胞排列整齊，在中央靜脈周圍呈放

11、射狀分布，肝細(xì)胞中央有大而圓的核，細(xì)胞質(zhì)均勻，未見脂滴和炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)；HFD組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫脹，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見大量脂滴空泡，以中央靜脈周圍最為明顯，重者胞質(zhì)疏松呈網(wǎng)狀改變，且可見小葉內(nèi)及匯管區(qū)炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)。
　　透射電鏡觀察：ND組肝細(xì)胞中細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完好，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞漿內(nèi)無脂滴及脫顆?，F(xiàn)象，線粒體膜、嵴結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊；HFD組肝細(xì)胞內(nèi)可見大量大小不等的脂滴分布，線粒體有一定程度

12、的腫脹，內(nèi)外膜部分融合，線粒體嵴變少變短，部分或全部消失，甚至出現(xiàn)空泡化。
　　結(jié)論：
　　1高脂飲食誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，具有高血糖、高胰島素血癥、高脂血癥等特點(diǎn)。
　　2脂飲食導(dǎo)致大鼠肝細(xì)胞脂肪變性及線粒體超微結(jié)構(gòu)的異常。
　　3高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠肝臟Mfn2表達(dá)降低，Mfn2與胰島素抵抗的發(fā)生相關(guān)。
　　第二部分 Mfn2對(duì)胰島素抵抗大鼠肝臟GK、PEPCK活性的影響
　　目的：觀察腺病

13、毒介導(dǎo)的Mfn2轉(zhuǎn)染對(duì)胰島素抵抗大鼠糖代謝相關(guān)酶葡萄糖激酶(glucoskinase，GK)及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoen-olpyruvate carboxykinase，PEPCK)的活性影響。
　　方法：實(shí)驗(yàn)8周末判斷胰島素抵抗大鼠模型建立成功后，將高脂組剩余60只大鼠隨機(jī)分為5組，分別為：高脂對(duì)照組(Con)12只、空載體對(duì)照組(empty Ad adenovirus，Ad)12只、Ad-Mfn2低劑量組(1

14、×108 v.p/kg)12只、Ad-Mfn2中劑量組(1×109v.p/kg)12只、Ad-Mfn2高劑量組(1×1010 v.p/kg)12只。以鼠尾靜脈注射的方式，Con組給予磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)，Ad組給予空載體(1×109 v.p/kg體重)，Ad-Mfn2低中高劑量組分別給予相應(yīng)劑量Mfn2的重組腺病毒。每周1次，連續(xù)3周。給予腺病毒干預(yù)3周后，進(jìn)行清醒狀態(tài)下高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)，計(jì)算GIR，處死動(dòng)物并留取血清

15、及肝組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。血糖、血胰島素及游離脂肪酸測(cè)定方法同第一部分。肝臟糖原含量采用肝糖原試劑盒測(cè)定。肝GK及PEPCK活性采用酶偶聯(lián)比色法測(cè)定。
　　結(jié)果：
　　1給予Mfn2重組腺病毒干預(yù)3周后，各組大鼠肝臟Mfn2 mRNA及蛋白表達(dá)的比較
　　隨著Ad-Mfn2劑量增加，大鼠肝臟Mfn2 mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，與Ad組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　2給予Mfn2重組腺病毒干預(yù)3周后

16、，各組一般指標(biāo)的比較
　　隨時(shí)間延長(zhǎng)各組大鼠體重均增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。大鼠FBG、INS隨著Ad-Mfn2劑量增加而降低，而GIR升高，與Ad組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3各組肝臟糖原含量的比較
　　8周末：HFD組肝糖原含量(4.29±0.45 mg/g)較ND組(5.31±0.63mg/g)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　給予Mfn2重組腺病毒干預(yù)3周后：肝

17、糖原含量隨著Ad-Mfn2劑量增加而升高，Ad-Mfn2中、高劑量組肝糖原含量與Ad組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　4各組大鼠肝臟GK、PEPCK活性的比較
　　8周末：HFD組肝臟GK活性(7.70±1.41 mIU/(min·mg protein))較ND組(13.87±1.72 mIU/(min·mg protein))低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而PEPCK活性(18.40±2.20 mIU/

18、(min·mg protein))較ND組(10.67±2.50 mIU/(min·mg protein))高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　給予Mfn2重組腺病毒干預(yù)3周后：與Ad組相比，肝GK活性隨著Ad-Mfn2劑量的增加而升高，PEPCK活性隨著Ad-Mfn2劑量的增加降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　5給予Mfn2重組腺病毒干預(yù)3周后，大鼠肝臟形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的改變
　　光鏡下觀察：Ad

19、組可見肝小葉結(jié)構(gòu)明顯紊亂，肝細(xì)胞索消失，肝細(xì)胞變大，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見大量圓形脂滴空泡，核居邊，且小葉內(nèi)炎細(xì)胞侵潤(rùn)程度增加。Ad-Mfn2不同劑量組可見肝細(xì)胞體積較高脂組變小，胞漿內(nèi)脂滴減少。
　　透射電鏡觀察：Ad組肝細(xì)胞胞漿中可見大量脂滴，肝細(xì)胞核不規(guī)整，線粒體膜模糊不清，部分膜破裂，線粒體嵴幾乎消失不見，偶有少量殘存，有空泡樣變；Ad-Mfn2不同劑量組肝細(xì)胞胞漿中脂滴較高脂組數(shù)量少，線粒體腫脹減輕，內(nèi)外膜部分融合，線粒體嵴部

20、分或大部分消失。
　　結(jié)論：
　　1高脂飲食可導(dǎo)致大鼠血糖水平升高，肝糖原含量減少，糖酵解及氧化關(guān)鍵酶GK活性降低、糖異生關(guān)鍵酶PEPCK活性增加，引起糖代謝異常。
　　2上調(diào)Mfn2表達(dá)，胰島素抵抗大鼠肝糖原含量升高，GK活性增加、PEPCK活性降低，并且使肝細(xì)胞脂肪變性和線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷減輕。Mfn2改善胰島素抵抗可能與調(diào)節(jié)GK、PEPCK活性及影響線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān)。
　　第三部分 Mfn2對(duì)胰島素抵抗大

21、鼠肝臟ACCα、CPT-Ⅰα表達(dá)的影響
　　目的：觀察腺病毒介導(dǎo)的Mfn2轉(zhuǎn)染對(duì)胰島素抵抗大鼠脂代謝相關(guān)酶乙酰輔酶A羧化酶α(acetyl CoA carboxylaseα，ACCα)、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-Ⅰα(carnitine palmitoyltransferase-Ⅰ，CPT-Ⅰα)表達(dá)的影響。
　　方法：動(dòng)物分組及處理同第一、二部分。肝臟TG含量按試劑盒說明測(cè)定，Real time PCR測(cè)定肝組織ACCα、CPT

22、-Ⅰα mRNA水平，Western blot方法檢測(cè)ACCα、CPT-Ⅰα蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　1給予Mfn2重組腺病毒干預(yù)3周后，各組大鼠血液一般指標(biāo)的比較
　　血TG、TC及FFA水平隨著Ad-Mfn2劑量的增加而降低，Ad-Mfn2中、高劑量組TC、FFA水平低于Ad組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ad-Mfn2高劑量組TG水平低于Ad組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　2各組大鼠肝臟

23、TG含量的比較
　　8周末：HFD組肝臟TG含量(595.35±159.24μmol/L)高于ND組(371.75±105.47μmol/L)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　Mfn2重組腺病毒干預(yù)3周后：肝臟TG含量隨著Ad-Mfn2劑量的增加而降低，與Ad組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3各組大鼠肝臟CPT-Ⅰα和ACCα mRNA及蛋白水平的比較
　　8周末：HFD組肝臟CPT-Ⅰα

24、mRNA表達(dá)及蛋白水平較ND組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HFD組ACCα mRNA水平較ND組高，但蛋白磷酸化水平低于ND組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　Mfn2重組腺病毒干預(yù)3周后：CPT-ⅠαmRNA及蛋白表達(dá)隨Ad-Mfn2劑量的增加而升高，與Ad組相比，以中、高劑量組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Ad組相比，ACCα mRNA水平隨著Ad-Mfn2劑量的增加而降低，而蛋白磷酸化水平則升高

25、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1高脂飲食可導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積，脂肪酸氧化關(guān)鍵酶CPT-Ⅰα表達(dá)降低，脂肪酸合成關(guān)鍵酶ACCα磷酸化水平降低。
　　2上調(diào)Mfn2表達(dá)，胰島素抵抗大鼠血脂降低，肝臟脂質(zhì)沉積減輕，脂代謝相關(guān)酶CPT-Ⅰα表達(dá)升高，ACCα磷酸化水平升高。Mfn2改善胰島素抵抗可能與CPT-Ⅰα表達(dá)升高及ACCα活性降低，改善脂代謝異常有關(guān)。
　　第四部分 Mfn2改善胰島素抵抗的

26、機(jī)制研究
　　目的：測(cè)定胰島素抵抗大鼠肝臟及HepG2細(xì)胞胰島素信號(hào)通路磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(proteinkinase B，PKB/AKT)途徑相關(guān)分子的表達(dá)，探討Mfn2改善胰島素抵抗的具體作用機(jī)制。
　　方法：胰島素抵抗大鼠模型及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)同第一、二部分。細(xì)胞培養(yǎng)：分別用含0.25 mmol/L軟脂酸(palmitate，PA)培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)

27、基(normalcontrol，NC)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞24小時(shí)后采用葡糖糖氧化酶法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液的葡糖糖含量。判斷胰島素抵抗模型建立成功后，設(shè)立軟脂酸對(duì)照組(Con)、軟脂酸空載體組(Ad)、Ad-Mfn2低劑量組(50 pfu/cell，Mfn2L)、Ad-Mfn2高劑量組(100 pfu/cell，Mfn2H)。Con組給予PBS緩沖液，Ad組按50 pfu/cell空載體給予，Ad-Mfn2低劑量組按50 pfu/cell給予A

28、d-Mfn2，Ad-Mfn2高劑量組按100 pfu/cell給予Ad-Mfn2。培養(yǎng)24h后，測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)基葡萄糖含量，并采用Real time PCR、Western blot方法分別檢測(cè)各組Mfn2、INSR、IRS2、PI3K、AKT2、GLUT2 mRNA及蛋白水平表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1 HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗體外模型建立
　　PA組葡萄糖含量(12.16±0.54 mmol/(L·mg pr

29、otein))較Con組(16.02±0.73 mmol/(L·mg protein))高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明用軟脂酸誘導(dǎo)胰島素抵抗體外細(xì)胞模型成功建立。
　　2 HepG2胰島素抵抗細(xì)胞Mfn2及胰島素信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)
　　PA組Mfn2 mRNA水平(0.48±0.11)較Con組(0.97±0.03)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PA組Mfn2的蛋白表達(dá)量(0.46±0.06)較Con

30、組(0.90±0.11)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PA組INSR、IRS2、GLUT2 mRNA及蛋白表達(dá)較Con組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PA組PI3K、AKT2 mRNA及總蛋白水平與Con組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但是PI3K和AKT2蛋白磷酸化水平較Con組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3 MTT法檢測(cè)Ad、Ad-Mfn2對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響，Ad組、Mf

31、n2低劑量及高劑量組細(xì)胞增殖率無明顯差別。
　　4 Mfn2重組腺病毒干預(yù)后各組HepG2細(xì)胞胰島素敏感性的比較
　　Mfn2L組及Mfn2H組細(xì)胞培養(yǎng)液葡萄糖含量較Ad組降低(P<0.01)。
　　5 Mfn2重組腺病毒干預(yù)后各組細(xì)胞Mfn2及胰島素信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)
　　Mfn2L組及Mfn2H組HepG2細(xì)胞Mfn2表達(dá)較Ad組顯著增加(P<0.01)，INSR、IRS2、GLUT2 mRNA水平及蛋白

32、表達(dá)量較Ad組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Ad組相比，PI3K、AKT2 mRNA表達(dá)水平及總蛋白表達(dá)量變化不顯著(P>0.05)，但其蛋白磷酸化水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　6大鼠肝臟INSR、IRS2、PI3K、AKT2、GLUT2 mRNA水平及蛋白表達(dá)的比較
　　實(shí)驗(yàn)8周末，HFD組大鼠肝臟INSR、IRS2、GLUT2 mRNA表達(dá)水平較ND組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

33、。PI3K、AKT2 mRNA及總蛋白水平與ND組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但PI3K和AKT2蛋白磷酸化水平較ND組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Fig.5。
　　Mfn2重組腺病毒干預(yù)3周后，轉(zhuǎn)染Ad-Mfn2的胰島素抵抗大鼠肝臟INSR、IRS2、GLUT2 mRNA及蛋白表達(dá)水平較Ad組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PI3K和AKT2蛋白磷酸化水平較Ad組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

34、0.05)。
　　結(jié)論：
　　1高濃度游離脂肪酸可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，伴隨Mfn2表達(dá)降低，胰島素信號(hào)通路相關(guān)的INSR、IRS2、GLUT2表達(dá)降低，PI3K、AKT2蛋白磷酸化水平下降。
　　2高脂誘導(dǎo)大鼠肝胰島素信號(hào)通路相關(guān)分子INSR、IRS2、GLUT2表達(dá)下降，PI3K、AKT2蛋白磷酸化水平下降。
　　3上調(diào)Mfn2表達(dá)，胰島素抵抗大鼠肝臟及HepG2細(xì)胞胰島素信號(hào)通路相關(guān)分子INSR