氧化苦參堿對(duì)高脂誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗和脂代謝影響的研究.pdf

1、隨著現(xiàn)代生活水平的提高，肥胖的發(fā)病率日趨增加，而胰島素抵抗（insulinresistance,IR）作為肥胖、2型糖尿病、高脂血癥、非酒精性脂肪肝等多種代謝性疾病的共同病理生理基礎(chǔ)，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。氧化苦參堿是從中藥苦參中提取的一種單體成分，既往研究表明氧化苦參堿具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)功能，近來(lái)研究表明氧化苦參堿與二甲雙胍聯(lián)合治療可顯著改善NAFLD患者的肝功能，明顯減輕肝臟脂質(zhì)沉積，增強(qiáng)其胰島素敏感

2、性，但具體機(jī)制尚不明確。
　　本研究擬在體外細(xì)胞水平，通過觀察氧化苦參堿對(duì)高脂誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞IR和脂代謝的影響，探討其改善IR和脂代謝的分子機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。
　　目的：觀察中藥制劑氧化苦參堿對(duì)高脂誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞IR和脂質(zhì)沉積的影響，從胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、脂代謝及氧化應(yīng)激方面探討其分子機(jī)制。
　　方法：采用高脂（含0.25mmol/L棕櫚酸培養(yǎng)基）誘導(dǎo)法建立HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗模型。將HepG

3、2細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組和高脂干預(yù)組，分別干預(yù)24小時(shí)后，利用葡萄糖氧化酶法測(cè)定培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，并計(jì)算葡萄糖消耗率，判定造模是否成功。造模成功后將高脂干預(yù)組隨機(jī)分為5組，分別為高脂組（Pa）、二甲雙胍組（Met）（二甲雙胍濃度0.20mg/mL）、氧化苦參堿低劑量組（Omt-L）（氧化苦參堿濃度為0.04mg/mL）、氧化苦參堿中劑量組（Omt-M）（氧化苦參堿濃度為0.08mg/mL）和氧化苦參堿高劑量組（Omt-H）（氧化苦參

4、堿濃度為0.16mg/mL），同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組（N）。分別干預(yù)48小時(shí)后收集細(xì)胞，采用相應(yīng)試劑盒測(cè)定各組HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，即谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）的活性及丙二醛（MDA）的含量；DCFH-DA（2,7-dichlorofuorescindiacetate）熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的含量；油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積程度；Real-TimePCR檢測(cè)He

5、pG2細(xì)胞胰島素信號(hào)通路上INSR、IRS-1、Akt及GLUT4與脂代謝通路上SREBP-1c、FAS、ACC、SCD-1、CPT-1及CD36的mRNA表達(dá)水平；WesternBlot檢測(cè)HepG2細(xì)胞GLUT4、CD36、FAS、ACC及SCD-1蛋白的表達(dá)水平，以及IRS-1和Akt的總蛋白及磷酸化蛋白水平。
　　結(jié)果：
　　1、HepG2細(xì)胞IR體外模型的建立
　　HepG2細(xì)胞經(jīng)高脂干預(yù)24小時(shí)后，Pa組葡

6、萄糖含量較N組升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示胰島素敏感性下降，表明棕櫚酸誘導(dǎo)IR體外細(xì)胞模型建立成功。
　　2、MTT法觀察藥物干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響
　　與N組相比，棕櫚酸干預(yù)24h能夠使HepG2細(xì)胞增殖抑制率上升，抑制率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與Pa組相比，Met、Omt-L、Omt-M、Omt-H均能降低HepG2細(xì)胞增殖抑制率（P<0.05），但未能恢復(fù)至N組水平，而Omt-

7、H2組則使HepG2細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，從而選取Omt-L、Omt-M、Omt-H三組的藥物濃度為氧化苦參堿干預(yù)濃度。
　　3、HepG2細(xì)胞胰島素敏感性的變化
　　3.1胰島素信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)基因表達(dá)水平的變化
　　與N組相比,Pa組HepG2細(xì)胞INSR、IRS-1、Akt、GLUT4的mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與Pa組相比,Met、Omt-M、Omt-H組干預(yù)后明顯上調(diào)GLUT4的m

8、RNA表達(dá)，與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05），并且同時(shí)上調(diào)IRS-1、Akt、INSR的mRNA表達(dá)（P<0.05），但未能恢復(fù)至N組水平；Omt-L可上調(diào)Akt及INSR的mRNA表達(dá)，但未恢復(fù)至N組水平（P<0.05），同時(shí)明顯上調(diào)GLUT4的mRNA表達(dá)（P<0.05），此外，Omt-L組干預(yù)后可上調(diào)IRS-1的表達(dá)，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3.2胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵分子的蛋白表達(dá)水平變化
　　與

9、N組相比，Pa組p-IRS-1/IRS-1的比值顯著升高，p-Akt/Akt與GLUT4/β-actin均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與Pa組相比，二甲雙胍及氧化苦參堿不同劑量干預(yù)組中p-IRS-1/IRS-1的比值顯著減低，而p-Akt/Akt、GLUT4/β-actin均顯著增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但p-Akt/Akt的比值未能恢復(fù)至正常水平。
　　4、藥物干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞脂代謝的影響

10、
　　4.1藥物干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響
　　油紅O染色及細(xì)胞內(nèi)TG含量測(cè)定結(jié)果顯示高脂干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯增加（P<0.05）；與Pa組相比，二甲雙胍及氧化苦參堿不同劑量干預(yù)組HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯降低（P<0.05）。
　　4.2棕櫚酸干預(yù)后HepG2細(xì)胞內(nèi)脂代謝相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平的變化
　　與N組相比，Pa組SREBP-1c、FAS、ACC、SCD-1及CPT-1的mRNA表達(dá)水平明顯下降

11、，CD36的mRNA表達(dá)水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與N組相比，SREBP-1c、FAS、ACC及SCD-1在Pa組的蛋白表達(dá)明顯降低，同時(shí)，CD36蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　4.3藥物干預(yù)后脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)及氧化關(guān)鍵因子的變化
　　與Pa組相比，二甲雙胍及氧化苦參堿不同劑量干預(yù)組CD36的mRNA水平顯著降低（P<0.05），其蛋白表達(dá)明顯下降（P<0.05）；與Pa

12、組相比，二甲雙胍及氧化苦參堿不同劑量干預(yù)組CPT-1的mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05）；
　　5、藥物干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
　　5.1活性氧（ROS）含量
　　與N組相比，Pa組細(xì)胞內(nèi)ROS的含量顯著增加；二甲雙胍及不同劑量的氧化苦參堿干預(yù)后可以顯著降低ROS含量。
　　5.2抗氧化酶T-SOD、GSH-Px及脂質(zhì)過氧化物MDA的含量
　　HepG2細(xì)胞經(jīng)棕櫚酸干預(yù)后，抗氧化酶GSH-Px

13、、T-SOD的活性較N組均顯著下降（P<0.05），脂質(zhì)過氧化物MDA的含量明顯增加（P<0.05），不同劑量氧化苦參堿及二甲雙胍干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)MDA較Pa組明顯減少（P<0.05)，T-SOD及GSH-Px的活性較Pa組明顯增高（P<0.05)，而藥物干預(yù)組組間沒有明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、氧化苦參堿可作用于胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路，減輕高脂誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞IR。
　　2、氧化苦參堿可通過抑制長(zhǎng)鏈