HBx對(duì)HepG2細(xì)胞脂代謝的影響及可能的機(jī)制.pdf

1、研究背景
　　據(jù)最新數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)約有9.3百萬(wàn)人為慢性乙肝病毒感染者，HBV感染及其導(dǎo)致的各種疾病，是我國(guó)所面臨的一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。最近，有報(bào)道在CHB和CHC患者中，肝脂肪變性與肝纖維化程度獨(dú)立相關(guān)，后者與肝硬化和肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。在HBV感染中肝脂肪變發(fā)生率為27％-51％，但有關(guān)HBV與肝脂肪變關(guān)系及其相關(guān)分子機(jī)制，國(guó)內(nèi)外研究很少，尚未達(dá)成共識(shí)。脂肪肝是病毒感染、飲食等多種因素綜合作用引起的肝臟病變，即脂肪在肝細(xì)胞

2、內(nèi)的過(guò)多堆積。近年，隨著人民生活水平越來(lái)越高，國(guó)民生活方式和膳食模式發(fā)生了相當(dāng)大的變化，膳食中高脂飲食所占比例呈上升趨勢(shì)，同時(shí)脂肪肝的發(fā)生率也逐年上升。所以，HBV、高脂環(huán)境與肝脂肪變性的關(guān)系的研究具有重要意義。晚近有文獻(xiàn)報(bào)道HBx可能在HBV相關(guān)的肝細(xì)胞脂肪變發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但另有研究者有與此不同的觀點(diǎn)。因此，HBV是否通過(guò)HBx參與肝細(xì)胞脂肪變性的發(fā)生?其可能的分子機(jī)制是否與LXRα、SREBP-1、FAS等調(diào)節(jié)脂代謝的重要基

3、因有關(guān)?HBV、高脂環(huán)境和肝脂肪變性之間的關(guān)系如何?針對(duì)以上問(wèn)題，本研究擬建立表達(dá)HBx的HepG2/HBx細(xì)胞模型，首先觀察HBx對(duì)HepG2細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究油酸鈉處理HepG2/HBx細(xì)胞與HepG2細(xì)胞后，兩細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的差異，探討HBx在肝細(xì)胞脂代謝中的作用及可能的分子機(jī)制。本研究分以下兩部分。
　　第一部分 HBx對(duì)HepG2細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　目的
　　建立

4、表達(dá)HBx的HepG2/HBx細(xì)胞模型，探討HBx對(duì)脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　方法
　　1.將質(zhì)粒pIRES2-eGFP-HBx轉(zhuǎn)染入HepG2中，建立表達(dá)HBx的HepG2/HBx細(xì)胞模型(HepG2/HBx組)；以轉(zhuǎn)染空載體pIRES2-eGFP(HepG2/pIRES2組)及未轉(zhuǎn)染(HepG2組)的HepG2細(xì)胞作對(duì)照。
　　2.轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h，熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)；檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG含量；

5、RT-PCR方法檢測(cè)SREBP-1，LXRα mRNA表達(dá)水平；Western blot檢測(cè)HBx，LXRα及FAS蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果
　　1.在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h，HepG2/HBx細(xì)胞和HepG2/pIRES2細(xì)胞中有GFP的表達(dá)并隨時(shí)間延長(zhǎng)而增多、增強(qiáng)，僅在HepG2/HBx細(xì)胞內(nèi)有HBx表達(dá)，并且隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加(P<0.05)。
　　2.在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h，HepG2/H

6、Bx細(xì)胞內(nèi)LXR、SREBP-1的mRNA表達(dá)以及LXRα、FAS蛋白表達(dá)，在各相同時(shí)間點(diǎn)均較對(duì)照組明顯增加(P<0.05/0.01)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增多(P<0.05/0.01)，且與HBx表達(dá)量均呈正相關(guān)(P<0.05)。HepG2/HBx細(xì)胞內(nèi)TG含量與對(duì)照組相比，差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論
　　1.成功建立HepG2/HBx細(xì)胞模型。
　　2.HBx-L XRα-SREBP-1/FAS通

7、路參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，可能是引起肝細(xì)胞脂肪變性發(fā)生的重要分子機(jī)制之一。
　　第二部分 HBx對(duì)油酸鈉誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響
　　目的
　　在HepG2-HBx細(xì)胞模型基礎(chǔ)上給予油酸鈉處理，探討HBx對(duì)油酸鈉誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響。
　　方法
　　1.將質(zhì)粒pIRES2-eGFP-HBx轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中，建立表達(dá)HBx的細(xì)胞模型(HepG2-HBx)；以轉(zhuǎn)染空載體p

8、IRES2-eGFP(HepG2-pIRES2)和HepG2細(xì)胞(HepG2)作對(duì)照。轉(zhuǎn)染后每8h用熒光顯微鏡分別觀察各組細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)，取轉(zhuǎn)染后首次觀察到GFP表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)作為開(kāi)始給于油酸鈉處理的時(shí)間點(diǎn)。
　　2.油酸鈉處理各組細(xì)胞24h、48h(分別命名為HBx/OA組、空/OA組、G2/OA組)，TG含量測(cè)定及油紅O染色了解細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況；RT-PCR法檢測(cè)SREBP-1和LXRa的mRNA表達(dá)水平，Western

9、blot檢測(cè)HBx、LXRa及FAS蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果
　　1.油酸鈉處理時(shí)間點(diǎn)的確定：在轉(zhuǎn)染后8h各組細(xì)胞內(nèi)均未觀察到綠色熒光，而轉(zhuǎn)染后16h觀察到HepG2-HBx組和HepG2-pIRES2組細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光，故選擇轉(zhuǎn)染后16h作為開(kāi)始給于油酸鈉處理的時(shí)間點(diǎn)。
　　2.在相同油酸鈉處理的條件下，HBx/OA組細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量和TG含量與對(duì)照組相比均明顯增加(P<0.01)；給予油酸鈉處理細(xì)胞24h，HBx/O